高效液相色谱法测定血浆游离肉碱

高效液相色谱法测定血浆游离肉碱 药物分析杂志ChinJPharmAnal2005,25(10)II95 高效液相色谱法测定血浆游离肉碱 丁峰,朱秋毓,顾勇,林善锬 (复旦大学附属华山医院肾脏科上海200040) 摘要目的:建立血浆游离肉碱测定方法.方法:用HPLC方法测定血液透析患者的 血浆游离肉碱,并比较其补充肉碱前后的 疗效.结果:方法线性范围为12.5—200txmol?L,;最低检测浓度为5/~mol?L,,总 分析时间6.7min.肉碱平均保留时间 (5.47-4-0.24)min.高,中,低3种浓度的平均回收率为105.7%.批内,批问RSD为3.5% 和10.8%(n=6).血透病人(n= 108)补充肉碱前后的游离血浆浓度分别为(20.55-4-10.34)和(106.6? 51.15)Ixmol?L,,对照组浓度(n=28)为(5O.07-4- 16.18)Ixmol?L,.结论:HPLC法测定血浆游离肉碱浓度灵敏,可靠,简便,适用于快 速检测血透病人肉碱缺乏症和评价补 充肉碱疗效的临床工作. 关键词:HPLC;肉碱;方法学 H]f'LCDete:rminationofFreeCarnitineinHumanPlasma DINGFeng,ZHUQiu—yu,GUYong,LINShan—tan (DepartmentofNephrology,HuashanHospital,FudanUniversity,ShanShai200040,China ) AbstractObjective:Todevelopaquantitativemethodforthedeterminationoffreecamitinein humanplasma. Method:Freecarnitineinplasmafromhealthype~onsorhemodialysispatientswasdetermin edbyhighperform- anceliquidchromatography(HPLC)andthecurativeeffectsofexogenouscamitinebeforean daftersupplementwere commentedon.Results:Thelinearityofthemethodrangedfrom12.5I~mol?L, to200I~mol-L一ofcarnitine withacorrelationcoefficientofmorethan0.9990.Minimumdetectlimitofthecarnitineinplasmawasfoundtobe 5I~mol?L,.Retentiontime(Rt)forthealimentis(5.47? 0.24)rainwithonly6.7minanalysisforasinglerun — time.Therelativestandarddeviation(RSD)waslessthan3.5%forwithin— dayand10.8%forbetween—day, respectively.Themeanrecoveriesofcarnitineinplasmawere105.7%atlow.middleandhighconcentration.Speci- mensanalyzedgaveameanvalueof(50.07?16.18),(20.55?10.34)and(106.6? 51.15)I~mol?L一inturns f0rcontrols(n=28)andthosepatients(n=108)whowereadministeredcarnitinebeforeandafter,respectively. Conclusion:Wehavepresentedareliable,fastandinexpensivemethodwithapplicabilitytobothdiagnosisandre- searchinclinicforthedeterminationofcarnitinefromplasma.Datafromtheclinictrialdemonstratedthatsupple— mentofthenutrienttothosepatientswhowereofcarnitinedeficiencysignificantlyaugmentedtheirlevelsinplasma withagreatimprovementonclinicalsymptomofinterest. Keywords:HPLC;carnitine;technology 左旋肉碱(C,H,NO)是一种具有多种生理功 能的内源性小分子化合物,广泛分布于心,肝,肾,骨 骼肌等重要组织器官中.其主要功能是促进脂肪酸 的燃烧,以提供能量使机体得以维持新陈代谢.近 来的研究表明?l2J,一些血液透析病人的透析并发 症同透析期间体内肉碱的损失有明显相关性.对这 些病人给予肉碱补充治疗可降低透析并发症并改善 病人的营养状态. 确定肉碱缺乏症并予以及时补充治疗需要快 速,准确的检测方法.国内外报道的检测方法主要 有放射性同位素法l3],光学法和高效液相色谱 法(HPLC)-7].同位素法不仅操作烦琐,污染环 境,且需要昂贵的肉碱乙酰转移酶作催化剂,导致分 析成本增高.光学法虽然成本低,但特异性差,灵敏 度低,难以满足分析方法学要求.为此,我们建立了 血浆肉碱的HPLC测定方法,现报告如下. 药物分析杂志ChinJPharmAnal2005,25(10) 1试剂 对一溴苯甲酰甲基溴化物(PBPB,HPLC纯), 四丁胺(TBA)及牛血清白蛋白(BSA,电泳纯)购自 Sigma公司;甲醇,乙腈购自上海豪申化学试剂有限 公司(AR规格),磷酸二氢钠,氧化银,柠檬酸,三乙 胺,异丙醇等试剂均购自中国医药集团上海化学试剂 公司(AR规格).左旋肉碱对照品由上海耐迪医药公 司惠赠,按中国药典(1995年版二部附录VD)测定,其 含量>98.5%.双重蒸馏水用于配制所有溶液. 2血样采集与处理 血样标本取自接受维持性血液透析的尿毒症患 者共计108例,男女之比为66:42,年龄42,68岁, 平均52.0岁.透析时间为15,63月,平均为42.2 月.所有人选患者均于每日透析后给予左旋肉碱口 服液补充,每日1支(1g?支),连续8周.于补 充左旋肉碱口服液前及服药8周后在动脉针端采集 血样.对照组血样取自无肾功能疾病者共计28例. 血样标本处理如下:新鲜血液0.5,1mL采集后置 于肝素管内,2000r?min离心10min后,吸取200 L血浆,一10?保存待测. 3衍生化试剂配制及衍生化反应 3.1衍生化试剂配制称取PBPB10mg,加入乙 腈500ILL及TBA40ILL,摇匀后4?冷藏待用.标 准肉碱储备液浓度为2mmol?L,,一10?保存备 用.工作液用7.5%的BSA水溶液将肉碱储备 液依次稀释至最终浓度为12.5,25,50,100,200 Ixmo1.L,,4?冷藏待用. 3.2衍生化反应操作吸取血浆或肉碱工作液50 ,加含有10%甲醇的乙腈溶液500IxL,摇匀后, 分别加入9:1的磷酸二氢钠一氧化银混合物100 mg及磷酸二氢钾100mg,于漩涡混合器上振荡5S, 4000r?min离心5min后,吸取上清液160IxL,加 入衍生化试剂20l,摇匀.70?温育1.5h后,取 上清液10L进样分析. 4色谱条件 高效液相色谱仪为Agilent1100系列(Agi. 1ent公司,USA),配备一台G1311A型四元泵, G1322A型脱气机,G1313A型自动进样器及 G1314A可变波长检测器.色谱柱为KromasilSil 柱,150mm×4.6mm,5m(瑞典Eka公司).流动 相由20%A和80%B组成,其中A为1.6mmol? L柠檬酸和4mmol?L三乙胺的水溶液,pH 6.4;B为含10%异丙醇的甲醇溶液,用前均经0.45 m膜(Millipore公司)过滤.检测波长260nm.流 速为0.7mL?min,.进样量为10L. 5数据处理 所有色谱数据均按峰面积由Agilent提供的软 件"化学工作站"(VersionA.09.01)自动进行定量 计算.结果表示为均值-4-标准差(sD).统计分析 用配对学t检验,P<0.001表示为有统计差异. 6结果 6.1色谱分离图1一A,B,c,D分别为200Ixmol ? L肉碱对照品,正常人,血透病人服药前和服药 8周后的血浆样本色谱分离图.肉碱平均保留时间 为(5.47?0.24)min.总分析时间为6.7min.肉 碱在12.5,200Ixmol?L浓度范围内,相关系数 >0.9990(/7,=4),相应的回归方程为: Y=0.8943+0.42 肉碱在血浆中的最低检测浓度(S/N?3)为5Ixmo1 . L_. 02460246t/mia 图l200m0l?L肉碱标准(A)及正常人(B),病人补充肉碱前 (c)后(D)的血浆色谱分离图 Fig1Typicalchromatogramsoffree一,J—camitineinplasmafrom200 mol?L一standard(A),normal(B),uremiapatientbefore(c)andaf- ter(D)supplementcarnitine,respectively 1.肉碱(carnitine) 6.2回收率与精密度取血浆50,分别掺人 12.5,50,100或200Ij,mol?L(最终浓度)的肉碱 对照品液,按"3"项下作衍生化反应进行回收率测 试,结果表明回收率为101.5%,110.2%,平均 105.7%.日内和日间的精密度(RSD)测定结果分 别为3.5%和10.8%(n=6). 6.3样品稳定性对置于室温下(20—30oC)的肉 碱样品每隔3h进行3次测定,连续测定12h以观 察其稳定性.结果表明此肉碱一溴苯甲酰甲酯衍生 物非常稳定,12h的峰面积变化(RSD)<10%. 6.4血透病人补充肉碱前后的血浆浓度测得值 药物分析杂志ChinJPharmAnal2005,25(10) 28例对照组基础血浆肉碱水平测得值为(50.074- ,108例血透病人补充肉碱前后的 16.18)Ixmol?L, 血浆浓度测得值分别为(20.554-10.34)Ixmol?L 和(106.64-51.15)Ixmol?L,,对照组同血透病人 服药前的血浆浓度和病人服药前后的血浆肉碱水平 间均有显着统计学差异(P<0.001). 7讨论 同文献报告的其他测定血浆肉碱的方法相比, 上世纪80年代发展起来的HPLC方法因具有高灵 敏度,高特异性等优点,故被认为是测定肉碱的首选 方法.早期由Minkler等人发展的HPLC法需要先 用离子交换柱对样品进行脱盐,然后再对洗脱液进 行冷冻干燥等,不仅操作步骤极为烦琐,且需用复杂 的梯度洗脱系统对样品进行分离j,因而不适用于 临床大批量标本的测定.Lever_6等人对此作了改 进,用乙腈进行肉碱提取而替代用离子交换树脂的 脱盐过程,同时用异丙醇一柠檬酸盐缓冲液体系作 流动相进行等度分离,获得理想的分离效果.该流 动相缺点是粘度较高,从而导致较高的柱压.为此, 我们在流动相中用甲醇代替异丙醇以降低粘度,实 验证明,该流动相在不影响分离度的情况下,可明显 降低柱压,从而延长色谱柱的使用寿命. 血浆中的氯离子对肉碱一PBPB衍生物的 HPLC分离有极大干扰.故需要衍生化试剂与肉碱 进行充分的混合以使试剂中的银离子能和血浆中的 氯离子充分作用而消除后者的干扰.充分的混合也 能提高肉碱一PBPB衍生物的产率.文献[7]采用 振摇1h的方法以保证反应的完全性.我们改用在 漩涡混合器上振荡5min,证明同样能达到反应完 全,从而缩短样品预处理时间. 衍生化反应温度与反应时间对肉碱一溴苯甲酰 甲酯衍生物的产率也有一定影响.我们为此进行了 实验优化研究.对上二因素各取4水平(温度:40, 60,70,80?;时间:1,1.5,2,2.5h)进行正交实验 研究,结果表明以70~C/1.5h条件较为理想. 肉碱标准曲线范围扩至1mmol?L时证明浓 度与信号间的相关性仍非常良好(数据未提供),由 于极少出现血浆肉碱水平>200Ixmol?L的情 况,因此我们将标准曲线线性范围设定为12.5, 200Ixmol?L,. 本研究结果表明,同正常人平均50Ixmol?L 的血浆肉碱浓度相比,血透病人的明显偏低(20.55 Ixmol?L)(P<0.001).由于肉碱为水易溶性小 分子化合物,透析造成病人的肉碱丢失情况相当严 重.给予血透病人补充肉碱有助于提高其血浆游离 肉碱水平,弥补其因透析造成的肉碱丢失,从而改善 肉碱缺乏的相关临床症状和体症.由测得结果可 知,经连续补充肉碱8周后血透病人的肉碱基础水 平从平均21Ixmol?L增至平均107Ixmol?L,, 前后血浆浓度变化有显着性统计学差异(P< 0.001).详细的临床研究将另文报告. 8结论 本文发展的HPLC测定血浆游离肉碱的方法, 快速,简便和灵敏,非常适用于临床快速检测血透病 人肉碱缺乏症和评价补充肉碱疗效的临床工作之 需. 参考文献 1Gol~rTA,Wo~onM,AhmadS,eta1.MulticentretrialofL—carni— fineinmaintenancehemodialysispatients.I.Carnitineconcentrations andlipideffects.Kidneylnt,1990,38:904 2MEIChang—lin(梅长林),XUHong—shi(徐洪实),GUShu—hua (顾书华),eta1.Thedeterminationoffreecarnitineanditsclinical significanceinhemodialysispatients(血液透析病人血浆游离肉碱 测定及临床意义).ChinJMedLabSci(中华医学检验杂志), 1998,21(6):355 3RossleC,KohseKP,FranzHE,eta1.Animprovedme~odforthede— terminationoffreeandesterfiedcarnitine.ClinChemActa,1985,149: 263 4FullerRK,HoppelCL.Elevatedplasmacarnitineinhepaticcirrhosis. Hepatology,1983,3(4):554 5MinklerPE,IngallsST,Hoppe1.High—performanceliquidc~omato— graphicseparationofacylcarnitinesfollowingderivatizationwith4一 bromophenacyltrifluoromethylsulfonate.AnalBiochem,1990,185:29 6LeverM,BasonL,LeaveC,eta1.Same—daybatchmeasurementof glycinebetmne,carnitineandotherbetmnesinbiologicalmateria1.A— nalBiochem1992,205:14 7VazFM,MeleghB,BeneJ,eta1.Analysisofcarnitinebiosynthesis metabolitesinurinebyHPLC——electrospraytandemmassspectrome?- . ClinChem,2002,48(6):826 (本文于2004年6月21日收到)