缩泉丸含药血清对小鼠胚胎干细胞增殖及Nanog基因表达的影响

缩泉丸含药血清对小鼠胚胎干细胞增殖及Nanog基因达的影响 缩泉丸含药血清对小鼠胚胎干细胞增殖及 Nanog 基因表达的影响 操红缨，徐晶晶，吴清和，黄萍 (广州中医药大学中药学院，广州 510006) 5 摘要:目的:研究缩泉丸含药血清对小鼠胚胎干细胞增殖及 Nanog 基因表达的影响。: 选用 129 小鼠胚胎干细胞株，加入缩泉丸含药血清，流式细胞仪补肾缩尿复方对胚胎干 细胞增殖的影响，real-time PCR 及流式法检测 Nanog 基因 mRNA 及蛋白的表达。结果:缩 泉丸含药血清能够促进胚胎干细胞的增殖，上调 Nanog 基因 mRNA 及蛋白的表达。结论: 补肾缩尿法可以促进 ESCs 的增殖，可能与其上调关键基因 Nanog 的表达相关。 10 关键词:中药药理;缩泉丸;血清药理学;胚胎干细胞;Nanog 中图分类号:R285.5 Effect of Suoquanwan drug-containing serum on proliferation activitie and expression of Nanog gene of 15 embryonic stem cell CAO Hongying, XU Jingjing, WU Qinghe, HUANG Ping (Guangzhou University of Chinese Medicine, GuangZhou 510006) Abstract: Objective: To explore effects of Suoquanwan(SQW) drug-containing serum on proliferation activitie and expression of Nanog gene of embryonic stem cell. Methods: Embryonic 20 stem cell line 129 was used as a model. SQW drug-containing serum was added to 129 medium. Flow Cytometer was used to detect nourishing kidney and reducing urination herbals on 129 cell proliferation, Real-Time Quantitative RT-PCR and Flow Cytometer were used to observe the mRNA and protein expression of Nanog gene of embryonic stem cell. Results: SQW drug-containing serum could promote 129 cell proliferation, it also up-regulated Nanog mRNA 25 and protein expression . Conclusion: The method of nourishing kidney and reducing urination could promote 129 cell proliferation, it may relate to raise the key gene Nanog expression. Keywords: Pharmacology of Chinese medicine; Suoquanwan; Serum pharmacology; embryonic stem cell; Nanog 30 0 引言 缩泉丸由益智仁、乌药、山药三味药所组成，具有温肾祛寒，缩尿止遗的功效。三药均 入肾经，方中益智仁温肾纳气、暖脾摄津，固涩缩尿为君药;乌药温膀胱、助气化，助君药 止小便频数;山药健脾补肾，可补后天之脾而益先天之肾。该方为历代沿用的经典方，具有 配伍严谨，药味精炼、疗效显著的特点。目前，尚未有从干细胞水平进行“补肾缩尿”功效 35 的实验研究。中医肾理论特别是肾精的内涵与胚胎干细胞、干细胞有着内在的联系。因此， 本研究观察补肾对胚胎干细胞增殖活动的影响，以及补肾对胚胎干细胞功能的关键决定基因 Nanog 在转录、表达及功能方面的调节。 基金项目:国家教育部博士点科研基金(20104425120002) 作者简介:操红缨，(1974-)，女，副教授，主要研究方向:中药药理。 通信联系人:黄萍，(1960-)，女，教授，主要研究方向:中药药理。E-mail: hping331@126.com -1- 1 材料 40 1.1 细胞株 129 小鼠胚胎干细胞，受赠于中山大学干细胞与组织工程研究中心项鹏教授 1.2 实验药物 受试药物:缩泉胶囊，湖南汉森制药有限公司，批号:100302 阳性对照药:金匮肾气丸，北京同仁堂科技股份有限公司，批号:0030377 45 1.3 试剂 DMEM(高糖)，由 gibco 公司提供;胎牛血清(FBS)，由 gibco 公司提供;L-谷氨 酰胺(L-Glutamine)，由 invitrogen 公司提供;非必需氨基酸(NEAA)，由 Hyclone 公 司提供;2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol)，由 invitrogen 公司提供;白血病抑制因子(LiF)， 由 millipore 公司提供;PD0325901，由 cayman 公司提供;CHIR-99021，由 cayman 公司提 供;0.25,胰酶，由 GIBCO 公司提供;明胶，由 sigma 公司提供;总 RNA 抽提试剂 Trizol， 50 由美国 MRC 公司提供;逆转录试剂 cDNA 试剂盒，由 Fermentas 公司提供;实时荧光定量 PCR 试剂，由 Fermentas 公司提供;Nanog、GAPDH 引物:由上海生工生物有限公司提供; DEPC(Amresco)，广州美津生物技术有限公司;氯仿、异丙醇、乙醇，均为国产分析纯 试剂;CFSE，由 eBioscience 公司提供;Anti-Mouse Nanog Alexa Fluor ?488，由 eBioscience 公司提供;流式着色缓冲液，由 eBioscienc 公司提供;固定破膜液，由 eBioscience 公司提 55 供;固定破膜稀释液，由 eBioscience 公司提供。 1.4 仪器 HVE-50 高温灭菌柜:HIRAYAMA 产品;TL-4 显微镜:Olympus 产品;纯水机:RODZ-50 (H)-RE 锐思捷;TDL-5 离心机:上海安亭科学仪器产品;ABI 实时定量 PCR 仪:由爱普 拜斯应用生物系统贸易有限公司提供;FACS Canto?流式细胞仪:BD 公司;培养瓶，6 孔 60 板均为 Corning 产品。 2 方法 2.1 细胞培养、传代 细胞接种前，培养器皿底部表面先用 0.1%的明胶包被 30min，采用无饲养层法培养于完 全培养基中，37?、5,CO2 条件下培养。完全培养基:90%高糖 DMEM，加 10%胎牛血清、 65 1% L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、106U/L LiF、0.1 mM 巯基乙醇、1uM PD0325901、3 uM Chir99021。每 2 天更换培养液，约 3~ 5 天当 ESCs 达到接近融合状态时，加入 3 倍稀释的 胰酶消化，镜下见细胞团内部松散，且相邻的细胞分开，即终止消化，加入 ESCs 培养液， 吸管轻柔吹打，使贴壁生长的 ESCs 落入培养液中，制成单细胞悬液，按 1:6 传代。 2.2 动物分组及含药血清的制备 70 将动物分为 5 组，10 只/组。设置组别为:对照组、金匮肾气丸组、缩泉丸高、中、低 剂量组。高、中、低剂量组以成人用药剂量 10、5、2.5 倍(1.170、0.585 、0.293 g /kg) 灌 胃，对照组给予同体积蒸馏水。给药连续 3 天，上下午各给药一次。末次给药后 1h 腹主动 脉采血，静置 1h，3000r,min 离心分离并收集含药血清，56?常规灭活 30 min，0.2μm 滤 -2- 75 膜过滤除菌，-80?冰箱保存备用。 2.3 观察指标及检测 2.3.1 缩泉丸含药血清对 ESCs 增殖的影响 细胞增殖实验采用荧光染料 CFSE( 1.25uM )标记 ESCs 细胞，置于 CO2 培养箱中培 养。加入含药血清作用 2 天后收集细胞，用 PBS 洗涤细胞 1 次，重悬细胞，应用流式细胞 80 仪进行检测。在分析 CFSE 标记 129 细胞分裂增殖的情况时，圈定目的细胞群，观察其 CFSE 密度减低的情况，以刚染完色未经增殖的细胞的平均荧光强度做对照。 缩泉丸含药血清对 ESCs Nanog mRNA 表达的影响 2.3.2 ESCs 常规培养，接种在 6 孔板中，加入 10,含药血清以及等体积空白对照血清作用 2 OD260/280 比值在 1.8-2.0 之间为较纯 天。总 RNA 的提取:使用 Trizol 溶液提取总 RNA， 85 的 RNA，按 Fermentas 试剂盒说明进行反转录和 Real -Time Quantitative PCR 扩增。检测方 法:SYBR Green?嵌合荧光法。数据收集由 7500 System SDS Software 自带软件完成，采 -??Ct 用 2 方法对目标基因(Nanog)的 mRNA 表达进行相对定量，计算出实验组与对照组的 RNA 表达的差别。 扩增基因 引物 ， ， 扩增长度(bp) 序列(5 ,3 ) ggtgaaggtcggtgtgaacg GAPDH 233 ctcgctcctggaagatggtg ctgctactgagatgctctgcac Nanog 106 agcttttgtttgggactggtag 缩泉丸含药血清对 ESCs Nanog 蛋白表达的影响 2.3.3 ESCs 常规培养，接种在 6 孔板中，加入 10,含药血清以及等体积空白对照血清作用 2 90 天后，用流式细胞仪检测细胞内 Nanog 蛋白的表达。细胞内蛋白染色采用一步法:用 PBS 重悬，调整细胞浓度为 1×106/ml，离心，加 1ml 细胞固定破膜工作液到每管中，4?避光孵 育 18h，直接加 2 ml 流式染色缓冲液到每管中，室温离心 5min,弃上清，用 100ul 流式染色 缓冲液重悬，直接加适量抗体(0.06ug/test)，室温避光孵育至少 30min,用 Rat IgG2a 作同 95 型对照，用流式染色缓冲液洗 2 次后重悬到合适体积，上机检测。 3 结果 3.1 缩泉丸含药血清对 ESCs 增殖的影响 结果见图 1。由图 1 可见，CFSE 标记过的 ESCs 培养 2 天后，因 ESCs 特有的增殖能 力，其荧光强度在直方图上表现为单峰(所有的细胞都有快速增殖的能力)。与对照组相比， 随着缩泉丸给药剂量的增加，其荧光强度逐渐降低，说明缩泉丸含药血清有促进 ESCs 增殖 100 的能力。 -3- 6，691 6，371 对照组 低剂量 4，388 1，199 105 中剂量 高剂量 1，166 肾气丸 图 1 缩泉丸含药血清对 ESCs 增殖作用的影响 Fig. 1 Effect of Suoquanwan drug-containing serum on ESCs proliferation 110 3.2 缩泉丸含药血清对 ESCs Nanog mRNA 表达的影响 结果见表 1，图 2-5。图 2-5 为 ESCs 的 GAPDH、Nanog 的 Real-Time PCR 融解曲线和 扩增曲线，融解曲线单一峰无非特异性荧光，说明产物特异性强，无引物二聚体，定量准确。 表 1 结果表明，与对照组相比，缩泉丸高剂量能明显上调胚胎干细胞 Nanog mRNA 的表达 115 (P<0.05)。 -4- 表 1 缩泉丸含药血清对胚胎干细胞 Nanog mRNA 表达的影响( x , s ) Tab.1 Effect of Suoquanwan drug-containing serum on the expression of Nanog mRNA 剂量 组别 相对比值 n (g/kg) 对照组 6 1.00?0 — 低剂量组 6 0.293 1.31?0.22 中剂量组 6 0.585 1.20?0.22 高剂量组 6 1.170 1.43?0.20* 肾气丸组 6 1.080 1.27?0.11* 注:与对照组比较，* P<0.05 ，**P<0.01。 120 图 3 GAPDH 扩增曲线 图 2 GAPDH 引物熔解曲线 Fig. 2 Dissociation curve of GAPDH primer Fig. 3 amplification curves of GAPDH 125 图 4 Nanog 引物熔解曲线 图 5 Nanog 扩增曲线 Fig. 4 Dissociation curve of Nanog primer Fig. 5 amplification curves of Nanog 3.3 缩泉丸含药血清对 ESCs Nanog 蛋白表达的影响 130 结果见图 6。图 6 中的实心图部分为 ESCs 内 Nanog 蛋白表达的荧光强度图，P2 区的 空心图部分为同型对照的荧光强度图，说明 Nanog 蛋白的表达是特异性的。图 6 表明，与 对照组相比，随着缩泉丸给药剂量的增加，其荧光强度逐渐增加，说明缩泉丸含药血清有促 进 ESCs Nanog 蛋白表达的能力。 -5- 1.075 1.092 对照组 低剂量 135 1.244 1.615 中剂量 高剂量 1.540 肾气丸 图 6 缩泉丸含药血清对 ESCs Nanog 蛋白表达的影响 140 Fig. 6 Effect of Suoquanwan drug-containing serum on the expression of Nanog protein 4 结论 目前 CFSE 标记的应用主要集中在 T、B 淋巴细胞的增殖上，其实这项技术还可用于其 他细胞类型，包括 NK 细胞、成纤维细胞甚至是细菌[1]。近年来，这项技术应用越来越广泛， 145 -6- 已经逐渐替代传统的 3H-TdR 法和 MTT 法，具有操作简单、使用方便、安全无辐射、观察 期长等诸多优点[2]。CFSE 是一种活体细胞标记染料，能与细胞内氨基结合偶联到蛋白质上， 当细胞分裂时 CFSE 荧光分子可平均分配到两个子代细胞中，因此各连续传代细胞是以亲代 细胞荧光强度的一半而递减[3]。胚胎干细胞是从囊胚期的内细胞团和早期胚胎的原始生殖细 150 [4]。ESCs 的一个显著特性就是能够 胞中分离得到的具有自我复制能力的多向分化潜能细胞 以一种自我更新的未分化的状态来无限地保持自我。Nanog 在维持 ESCs 全能性中是必需的， 在内细胞团( inner cell mass，ICM)、ESCs 和胚胎生殖细胞 ( embryonic germcells，EG)中都 有表达，而在已分化的细胞和成体组织中不再表达[5]。Nanog 基因除了有助于维持 ESCs 未 分化状态，还促进细胞增殖。有研究发现，Nanog 基因的表达能够推动小鼠成纤维细胞进入 DNA 合成期( S 期)，促进细胞的增殖。 155 实验表明，缩泉丸含药血清能够促进胚胎干细胞的增殖，上调 Nanog 基因 mRNA 及蛋 白的表达。提示，补肾缩尿法可以促进 ESCs 的增殖，可能与其上调 Nanog 基因的表达相关， 其具体的机制尚待进一步研究。 160 [参考文献] (References) [1] PARJSH CR(Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies [ J ] .Immunol Cell Biol ,1999,77 (6) :499-508. [2]李涛 , 孙振武 ,李玉晓 , 等 . CFSE 标记技术及其在细胞研究中的应用进展 [J]. 现代生物医学进 展,2007,7(2):317. [3]雷松,毛咏秋. 荧光染料 CFSE在实验性葡萄膜炎 T细胞增殖研究中的应用[J]. 四川大学学报, 2009; 40( 6) : 165 1127-1129. [4]Nagy A, Rossant JNagy R, et al. Derivation of completely cell culture derived mice from early- passage embryonic stem cells,J,. Proc Natl Acad Scid USA,1993,90( 18) : 8424- 8428. [5]Hart AH, Hartley L, Ibrahim M, et al. Identification, cloning and expression analysis of the pluripotency promoting Nanog genes in mouse and human. Dev Dyn, 2004,230 ( 1) :187-198. 170 -7-