慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染

慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染 慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染 一、 包装 1. 包装细胞 Lenti-X? Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf(P11); Lenti-X? shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P16) 2. 病毒载体及包装质粒 病毒载体:DNA组构建及中量提取; 包装质粒:商品化产品(Lenti-X? Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf(P12); Lenti-X? shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P17))或DNA中量提取(目前唯一使用来源); 3. 细胞转染 方法一: ); Lenti-X? Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf(P12Lenti-X? shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P17); 方法二: 按照Lipofectamine? LTX & Plus Reagent (Cat.No.15338,invitrogen)进行，简要中文说明如下: 6a. 转染前24小时，把4–5 x 10个293T细胞传代至10cm培养皿中，加入完全培养基至终体积10ml，培养过夜，转染时，细胞密度为80–90%; b. 293T细胞转染前2小时换上9ml新鲜的完全培养基; c. 用之前充分混匀PLUS Reagent，在EP管中加入15ug的DNA混合物 (pLVX-shRNA Plasmid DNA:pMDLg:pRes-Rev:pCMV-VSV-G 的摩尔比 为1:1:1:1)，15ul的PLUS Reagent，用Opti-MEM定容到500ul，标记为 Tube 1，温和混匀，室温孵育5分钟; d. 充分混匀Mix Lipofectamine LTX，在EP管中加入45ul的Mix Lipofectamine LTX和455ul的Opti-MEM，标记为Tube 2，温和混匀; e. 将Tube 1的溶液加到Tube 2中，温和混匀，室温孵育5分钟; Tube 1 (Plasmid DNA) Tube 2 (LTX) 455 µl Opti-MEM 15ug DNA MIX(pLVX-shRNA Plasmid DNA: pMDLg:pRes-Rev:pCMV-VSV-G=1:1:1:1) 15 µl PLUS Reagent 45 µl Mix Lipofectamine LTX Up to 500µl Opti-MEM 500 µl Total Volume 500 µl Total Volume f. 将1 ml 转染复合物逐滴加入前一天种好细胞的100mm皿中，边加边摇匀。 g. 将细胞放入置于37 ?、5 %CO2 培养箱中培养，12小时后换上新鲜的培 养基继续培养。 h. 转染后48-72h，收取培养上清，500g离心10min或利用0.45 μm 低蛋白 吸附滤膜去除细胞碎片和团聚的病毒; 方法三: C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf(目前唯一使用方法) 4. 病毒上清收集 转染后12h, 48h,72h分别收集一次; 二、 纯化 方法一: (i) 病毒上清(接一、包装 4.病毒收集). (ii) Add 51 ml of a 50% PEG 6000 solution. (iii) Add 21.7 ml of a 4 M NaCl stock solution. (iv) Add 23.3 ml of PBS. This will result in a final volume of 300 ml. The final PEG 6000 concentration will be 8.5% and the final NaCl concentration will be B0.3 M. (v) Distribute the sample as 150-ml aliquots in two 250-ml polypropylene wide-mouthed bottles. (vi) Store the bottles at 4 1C for 1.5 h. Mix contents every 20–30 min. (vii) Centrifuge bottles at 7,000g for 10 min at 4 1C using a Beckman fixed-angel JLA-10.500 rotor. (viii) After centrifugation, a white pellet should be visible. (ix) Carefully decant the supernatant and add 1.2 ml of 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, per bottle. Resuspend the pellets by vigorously pipetting liquid up and down. (x) Vortex the bottles vigorously for 20–30 s to further resuspend the pellets. (xi) Transfer the vector suspension into screw-cap microfuge tubes in aliquots of 100 ml. 。(xii) Snap-freeze the tubes in crushed dry ice and store at -80 C. a. 把去除细胞碎片和团聚的病毒上清转移至离心管，按照10ml的病毒上清加入2.5ml的50%PEG6000混合; b. 加入1.064ml的4M的NaCl混匀; c. 加入1.142ml的PBS混匀; d. 4?C下，孵育1.5h，每20-30min颠倒混匀; e. 4?C下，7000g离心10min。 f.小心移除上清，切勿触动白色沉淀，如果白色沉淀出现松动，可以在7000 g下短暂离心; g. 加入原病毒上清1/200 to 1/100 体积的PBS重悬沉淀病毒粒子; h. 立即对浓缩纯化的病毒粒子进行滴度测定，并分装后(50-100ul/管)冻存于-80?C超低温冰箱中; 上述所需试剂配制方法见Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.pdf(P3) 方法二: Lenti-X? Concentrator.pdf 三、 滴度测定 病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc; 病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc; 四、 感染 Lenti-X? Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf(P16); Lenti-X? shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P20); Lenti-X? Concentrator.pdf(病毒感染增强剂使用说明); a. 感染前24小时，把细胞传代至35 mm平皿中，加入完全培养基至终体积 3ml，培养过夜，感染时，细胞密度为80–90%; b. 把冻存于-80?C的病毒取出并在室温下冻融; c. 用新的完全培养基更换培养液，并加入冻融的病毒粒子(MOI为5-10)和polybrene(4 μg/ml)，培养液终体积为3ml; d. 感染8-24h后，用新3-4ml新完全培养基更换感染培养液; e. 感染48小时后收取细胞进行QPCR检测，感染72小时后收取细胞进行WB检测;