心房钠尿肽对力竭小鼠腓肠肌的抗氧化作用及其机制

心房钠尿肽对力竭小鼠腓肠肌的抗氧化作用及其机制 心房钠尿肽对力竭小鼠腓肠肌的抗氧化作 用及其机制 时珍国医国药2012年第23卷第1期LISHIZHENMEDICINEANDMATER1AMEDICARESEARCH2012VOL.23NO.1 4讨论r] 二甲苯致小鼠耳肿胀法和醋酸扭体法是筛选抗炎镇痛药物… 简便,有效,重复率强的.本实验结果明,紫椴花70%r4] 乙醇提取物对二甲苯引起的小鼠耳肿胀及醋酸引起的小鼠疼痛 均具有显着的抑制作用,证明了紫椴花对早期炎症及外周疼痛具『5] 有一定作用,其作用效果较临床常用抗炎镇痛药物阿司匹林稍显 于此实验结果,笔者将对紫椴花抗炎镇痛作用的有部位[6] 温和.基 及有效成分进一步深人研究,为开发紫椴的药用功能提供科学依 据,为紫椴资源的综合开发利用奠定基础. 参考文献:l_『 [1]周以良.黑龙江树木志,第1版[M].哈尔滨:黑龙江科学技术出版 社,1986:429. [2]国家林业总局.国家重点保护野生植物名录(第一批)[M].北京: 农业部,1999. 聂少全.黑龙江植物资源志,第1版[M].哈尔滨:东北林业大学出 版社,2003:651. 国家中医管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海:上海科 学技术出版社,1999:4312. 张玉凤,邵铁军,田润民,等.椴树次生代谢产物的研究[J].内蒙古 林业科技,2003,(3):37. MartinezAL.AntinociceptiveactivityofTiliaamericanavox.mexicana inflorescencesandquercetinintheformalintestandinanarthriticpain modelinrats[J].Neuropharmacology,2009,56(2):564. 陈奇.中药药理研究方法学,第2版[M].北京:人民卫生出版 社,2000. 徐叔云.药理实验方法学,第3版[M].北京:人民卫生出版社, 1982:884. 心房钠尿肽对力竭小鼠腓肠肌的抗氧化作用及其机制 刘丽萍,洪兰,于丽,李海雁,崔勋 (延边大学医学部基础医学院,吉林延吉133002) 摘要:目的观察游泳力竭小鼠血浆心房钠尿肽(atrialnatriureticpeptide,ANP)的分泌,并探讨ANP的抗氧化作用及其 机制.方法?对实验动物进行分组及负重游泳,力竭后立即测试腓肠肌乳酸,乳酸脱氢酶和血浆ANP含量;?观察ANP 对HO诱导小鼠腓肠肌MDA含量的影响及其机制探讨.结果?游泳力竭小鼠腓肠肌乳酸和乳酸脱氢酶含量明显增 高,与对照组比较有统计学意义(P<0.01);?游泳力竭小鼠血浆ANP含量明显增加,与对照组比较有统计学意义(P< 0.01);?ANP对H2O2致小鼠腓肠肌组织损伤有保护作用(P<0.001),而PKG的阻断荆LY83583又阻止了这种保护作 用(P<0.001).结论ANP具有抗氧化作用,其作用是通过cGMP---~PKG信号转导途径实现的. 关键词:心房钠尿肽;力竭;腓肠肌;抗氧化 D0I标识:doi:10.3969/j.issn.1008-0805.2012.01.060 中图分类号:R331.3文献标识码:B文章编号:1008-0805(2012)01-0136-02 心房钠尿肽(atrialnatriureticpeptide,ANP)是1981年De Bold等首次发现的由心房肌细胞合成和分泌的具有利钠利尿, ,抑制细胞增殖,调节免疫以及参与脂质 参与水盐平衡,降低血压 代谢等功效的肽类激素.目前,ANP作为一种快速反应型激素 在生理活动中所起的抗氧化作用已经引起了人们的广泛关注. MakotoShono等观察了心力衰竭患者体内ANP对氧化损伤的 影响,结果发现ANP参与心力衰竭时的抗氧化过程,具有减轻心 力衰竭氧化损伤的作用;AdrienneLaskowski等研究表明,ANP 对乳鼠心肌细胞具有保护作用.但ANP是否对运动模型具有抗 氧化作用及其机制还不甚清楚.因此,本研究采用力竭小鼠腓肠 肌,观察ANP抗氧化作用,并探讨其机制,为研究ANP功能及其 作用机制提供必要的实验依据. 1材料 LY83583(环一磷酸鸟苷依赖性的蛋白激酶阻断剂),购自美 国Sigma公司;乳酸(1acticacid,LD),乳酸脱氢酶(1actatedehy— drogenase,LDH),丙二醛(malondialdehyde,MDA)及组织蛋白测 试盒,购于南京建成生物工程研究所;其他试剂均为国产分析纯. 收稿日期:20117_26;修订日期:20119_22 基金项目:吉林省科技厅项目(No.20100590); 吉林省教育厅项目[No.(2008)4] 作者简介:刘丽萍(1974.),女(汉族),黑龙江勃利人,现任延边大学基础医 学院副教授,硕士学位,主要从事运动与心房钠尿肽分泌机制研究工作. 通讯作者简介:崔勋(1964.),男(朝鲜族),吉林延吉人,现任延边大 学基础医学院教授,博士学位,主要从事心房钠尿肽分泌机制研究工作. ? 136? 实验动物采用昆明种小鼠,体质量为18,22g,雄性,由延边 大学医学部实验动物科提供[合格证号:SCXK(吉)2003— 0005],饲养环境湿度为70%,温度为25?. 2方法 2.1动物分组及负重游泳力竭小鼠腓肠肌LD,LDH测试实验 对实验小鼠进行习惯性游泳训练,共游泳2次,两次问隔3d,每 次游泳30min,然后在小鼠尾部负重(体质量的5%)测量游泳基 础时间,共测3次,每次间隔3d.计算3次游泳基础时间平均值 和标准差,选择游泳基础时间标准差<10min的小鼠18只随机 分成对照组,应激组和游泳力竭组.对照组直接脱颈取腓肠肌; 应激组在水中自由活动(2O?2)S后取腓肠肌,水温(30?2)?; 力竭组小鼠尾部负重(体重的10%)游泳,水深20cm,水温等同 应激组,游泳至力竭(在水下10S仍不能浮出水面)后立即脱颈 取腓肠肌.用冰冷的生理盐水冲洗,滤纸吸干称重,冰浴下匀浆 制备成2.5%的匀浆液测LD,0.1%的匀浆液测LDH.组织匀浆 液LD,LDH及蛋白含量测试采用化学比色法,严格按照测试盒 说明书操作,利用721分光光度计(上海第三仪器厂)测定吸光 度,并根据公式计算LD,LDH及蛋白含量. 2.2游泳力竭小鼠血浆ANP含量测试实验小鼠游泳力竭后取 腓肠肌同时断头取血,EDTA抗凝,1500r/min离心10rain取血 浆,血浆ANP浓度测定采用放射免疫法测试.对照组和应激组 直接断头,按以上方法操作. 2.3ANP抗氧化的机制实验将24只小鼠脱颈处死,立即取出 腓肠肌,制备成30%的腓肠肌组织匀浆液.实验分为对照组, H2O2组,ANP+H202组,IJY83583+ANP+H2O2组.H2O2反应 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2012VOL.23NO.1时 珍国医国药2012年第23卷第1期 浓度为0.2mol/L;ANP最终反应浓度为13.1nr/ml;LY83583浓 度为0.3mmo~L.试管冰浴,匀浆液分装,每管200tL1.所有试 管均置于37~C恒温水浴中,先将LY83583+ANP+H202组预处 理20lLY83583,其它试管均加等量生理盐水,震荡恒温水浴中 孵育15min;然后ANP+H2O2组和LY83583+ANP+H202组分 别处理20IxlANP,其它试管均加等量生理盐水,孵育15min;最 后H2O2组,ANP+H2O2组,LY83583+ANP+H2O2组分别给予 20lH:O,对照组给等量生理盐水,孵育15min;所有样本的 MDA及蛋白含量测定严格按照测试盒说明书操作. 2.4统计学分析采用Prism(3.0版)统计软件进行统计学处 理.实验结果均?s表示,显着性差异采用t检验和单因素方差 分析(One—wayANOVA)进行检验.统计结果以P<0.05为具 有统计学意义. 3结果 3.1力竭小鼠腓肠肌I,D和LD含量力竭组小鼠腓肠肌乳酸含 量明显增高,与对照组相比(P<0.05);乳酸脱氢酶含量也明显 增加,与对照组相比(Pl<0.05);应激组乳酸和乳酸脱氢酶含量 与对照组相比有增加趋势,但没有统计学意义.结果见表1. 表1力竭小鼠腓肠肌LD和LDH含量(?s) 与对照组比较,P<0.05;n=6 3.2力竭小鼠血浆ANP含量力竭小鼠血浆ANP含量明显升 高,与对照组比较P<0.05;与应激组比较P<0.01. 表2力竭小鼠血浆ANP含量(?s)ng?lI1 组别ANP 对照 应激 力竭 9.49?0.70 9.89?1.09 13.15?1.65 与对照组比较,P<0.05;与应激组比较,P<0.01;n=6 3.3ANP抗氧化作用及其机制机体内的任何物质增加都有其 实际意义,为了验证力竭小鼠ANP增加是否参与机体的抗氧化 作用并探讨其可能的细咆信号转导途径,我们用离体腓肠肌做样 本,以H:O:致腓肠肌组织氧化损伤,观察ANP的抗氧化保护作 用;并且用蛋白激酶(PKG)阻断剂LY83583观察了ANP抗氧化 作用的可能机制.结果H:O(0.2mol/L)组MDA含量与对照组 比较明显升高(P<0.001.结果见表3;预处理ANP组,MDA含 量与HO组比较显着降低,甚至接近空白对照组的水平(P< 0.001.结果见表3.而预处理LY83583组与ANP组比较MDA 含量又明显升高(P<0.O1.结果见表3. 表3ANP对H202诱导腓肠肌MDA含量的影响(i?) nmol?mgprot一 组别MDA含量 对照 H202(0.2moLL) ANP(13.10ng/kg) LY83583f0.3mmo1//L 13.96?1.38 18.91?0.337… 13.93?1.276??? 15.38?0.749 H2O2组与对照组比较,…P<0.001;ANP组与H2O2组比较 P<0.001;LY83583组ANP组比较,P<0.01;n=20 4讨论 近年来,ANP抗氧化作用逐渐成为热门课题.FtirstR等 研究结果表明,ANP通过激活Racel,NADPH氧化酶和Nox来 诱导人内皮细胞的蛋白激酶磷酸化,认为ANP参与氧化应激过 程.前期研究表明,外援性的ANP对大鼠肾缺血一再灌注损 伤中具有一定的抗氧化保护作用.以上学者都是在病理或正常 情况下对ANP抗氧化的现象进行了初步观察.另有很多学者观 察了运动状态下ANP的变化.多数研究发现,最大负荷强度和 力竭运动后正常人和耐力运动员血浆ANP水平均显着提高, ANP的基因表达明显增加.但增加的ANP对于运动系统究竟起 什么作用,其发挥作用时是通过哪条信号转导途径实现的鲜有报 道. 本研究表明,小鼠激烈游泳运动后乳酸和乳酸脱氢酶均明显 增高,这表明力竭模型成立.同时检测血浆ANP含量明显增加, 这和其他学者研究结果吻合J.为了证明生成的ANP是否具有 抗氧化作用,我们对组织预先处理了ANP,然后做了经典的H:O: 氧化损伤腓肠肌组织的离体实验,通过测试脂质过氧化产物 MDA的生成量来反映组织氧化损伤的情况.结果表明预先处理 ANP组MDA含量明显下降,表明ANP对HO损伤腓肠肌具有 明显的保护作用. 既往的研究表明ANP在体内发挥生物学作用时与心脏,中 枢神经系统,血管,淋巴组织,肾脏组织及生殖器官等以结合形式 存在的A型钠尿肽受体(natriureticpeptidereceptor,NPR—A)结 合,在鸟苷酸环化酶的作用下,催化底物GTP生成环一磷酸鸟苷 (guanosin3,5cyclicmonophosphate,cGMP),而发挥其参与水 盐平衡,利钠利尿,舒张血管,调节血压,抑制细胞增殖以及参与 脂质代谢等作用.PKG又是cGMP的下游信号转导物质之一. 为了探讨ANP抗氧化作用是否也和cGMP,PKG相关,本实验在 处理ANP之前,用了PKG的阻断剂LY83583做了预处理,结果 表明,LY83583明显阻断了ANP对腓肠肌组织的抗氧化保护作 用.说明ANP的抗氧化作用和PKG的激活相关. 本研究结果显示,力竭运动时血浆ANP明显增加,增加的 ANP对运动机体骨骼肌具有抗氧化作用,其作用是通过cGMP— PKG信号转导途径实现的. 参考文献: ShonoM,YoshimuraM,NakayamaM,eta1.PredominantEffectofA一 .rypeNatriureticPeptideonReductionofOxidativeStressDuringthe TreatmentofPatientsWithHeartFailure[J].CircJ,2007,71(7): 1040. LaskowskiA,WoodmanOL,CaoAH,eta1.Antioxidantactionscontrib— utetotheantihypertrophice~ctsofatrialnatriureticpeptideinneonatal ratcardiomyocytes[J].CardiovascRes,2006,72(1):112. FtirstR,BruecklC,KueblerWM,eta1.AtrialNatriureticPeptideIn— 1inHuman ducesMitogen——ActivatedProteinKinasePhosphatase—— EndothelialCellsviaRaclandNAD(P)HOxidase/Nox2一Activation [J].CircRes,2005,96:43. 李英顺,申东洙.心房钠尿肽在大鼠.肾缺血再灌注损伤中的体外抗 氧化作用研究[J].中国西部科技,2009,11(8):31. GutkowskaJ,PaquetteA,WangD,eta1.Effectofexercisetrainingon cardiacoxytocinandnatriureticpeptidesystemsinovariectomizedrats [J].AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol,2007,293(1):267. ? 137? ]J1J]J]J1J 12345 [rlrlrLrL