维生素C是一种已糖醛基酸

维生素C是一种已糖醛基酸 维生素C是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做抗坏血酸，主要为还原型及脱氢型两种，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗氧化剂。 维生素C(还原型)纯品为白色无臭结晶，熔点190,192?，溶于水或乙醇中，不溶于油剂。在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件中较稳定，维生素C开始氧化为脱氢型抗坏血酸(有生理作用)。如果进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。 根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。常用的测定方法有 (1)2，6-二氯靛酚法 (还原型VC) (2)2，4-二硝基苯肼法 (总VC) (3)碘量法 (4)荧光分光光度法 一、2，6-二氯靛酚滴定法 1、原理: 还原型抗坏血酸还原染料2，6-二氯靛酚，该染料在酸性中呈红色，被还原后红色消失。还原型 抗坏血酸还原2，6-二氯靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样 品提取液还原2，6-二氯靛酚的量与样品中所含维生素C的量成正比。 2、试剂 ? 1%草酸溶液:称取10g草酸，加水至1000ml; ? 2%草酸溶液:称20g草酸，加水至1000ml; ? 维生素C标准液:准确称20mgVC溶于1%草酸中，并稀释至100ml，吸5ml于50ml容量瓶中，加入1%草酸至刻度，此溶液每毫升含有0.02mgVC; ? 0.02%2，6-二氯靛酚溶液:称取2，6-二氯靛酚50mg，溶于200ml含有52mg碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至250ml，过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内，应用过程中每星期标定一次。 标定一:吸标液(VC)5ml于三角瓶?加6%KI溶液0.5ml?加1%淀粉3滴?用0.001N KIO3标液滴定到淡兰色。 计算: 抗坏血酸浓度(mg/ml)= (V1 × 0.088)/ V2 V1 - 滴定时消耗0.001N KIO3标液的体积(ml) V2 -维生素C重量(g) 0.088 -1ml0.001N KIO3标液?维生素C的量(mg/ml) 标定二:吸5ml已知浓度V C标液 ? 加5ml1%草酸 ? 用染料2，6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉红色，在15秒不褪色为终点 计算:每毫升2，6-二氯靛酚相当于维生素C的毫克数等于滴定度(T) T= (C × V1)/ V2 C - 维生素C的浓度(mg/ml) V1 -维生素C的体积(ml) V2 -消耗2，6-二氯靛酚的体积(ml) ? 0.001N KIO3标液:吸0.1N KIO3溶液5ml?于500ml容量瓶内?加水至刻度，每毫升相当于VC0.008mg; ? 0.5%淀粉溶液; ? 6%KI溶液; 3、操作方法 ? 提取:称样50g?加2%草酸100ml?到入捣碎机中?处理?过滤?颜色若深可加白陶土 ? 滴定:吸5ml样液?于三角瓶?用染料滴定至粉红色?15秒内不褪色 计算: VC(mg/100g)=(V × T)/ W × 100 V -消耗染料体积(ml) T -1ml染料所能氧化维生素C的毫克数 W- 滴定时所有滤液中含有样品的克数 4、注意事项 ? 所有试剂的配制最好都用重蒸馏水; ? 滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考; ? 样品进入实验室后，应浸泡在已知量的2%草酸液中，以防氧化，损失维生素C; ? 贮存过久的罐头食品，可能含有大量的低铁离子(Fe2+)，要用8%的醋酸代替2%草酸。这时如用草酸，低铁离子可以还原2，6-二氯靛酚，使测定数字增高，使用醋酸可以避免这种情况的发生; ? 整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化; ? 在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消除; ? 测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积。 荧光法 1(原理 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺(OPDA)反应生成具有荧光的喹喔啉(quinoxaline),其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。 脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。本方法的最小检出限为0.022 g/ml。 2(适用范围 GB12392-90 本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定 3(仪器 3(1(实验室常用设备。 3(2(荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计。 3(3(打碎机。 4(试剂 本实验用水均为蒸馏水，试剂不加说明均为分析纯试剂。 (1)偏磷酸,乙酸液:称取15g偏磷酸，加入40ml冰乙酸及250ml水，搅拌，放置过夜使之逐渐溶解，加水至500ml。4?冰箱可保存7,10天。 (2)0.15 mol/L硫酸:取10ml硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1200ml。 (3)偏磷酸,乙酸,硫酸液:以0.15mol/L硫酸液为稀释液，其余同4.1.配制。 (4)50, 乙酸钠溶液:称取500g乙酸钠(CH3COONa•3H2O)，加水至1000ml。 (5)硼酸-乙酸钠溶液:称取3g硼酸，溶于100ml乙酸钠溶液(4.4)中。临用前配制。 (6) 邻苯二胺溶液:称取20mg邻苯二胺，于临用前用水稀释至100ml。 (7) 0.04%百里酚蓝指示剂溶液:称取0.1g百里酚蓝，加0.02mol/L氢氧化钠溶液，在玻 璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为10.75ml，磨溶后用水稀释至250ml。 变色范围:pH=1.2 红色 pH=2.8 黄色 pH,4.0 兰色 (8) 活性炭的活化:加200g炭粉于1L 1+9盐酸中，加热回流1~2h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110~120?烘箱中干燥，备用。 (9)标准 抗坏血酸标准溶液(1mg/ml):准确称取50mg抗坏血酸，用溶液(4.1)溶于50ml容量瓶中，并稀释至刻度。 抗坏血酸标准使用液(100μg/ml): 取10ml抗坏血酸标准液，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml。定容前试pH值，如其pH,2.2时，则应用溶液(4.3)稀释。 标准曲线的制备:取下述"标准"溶液(抗坏血酸含量10μg/ml)0.5、1.0、1.5和2.0ml标准系列，取双份分别置于10ml带盖试管中，再用水补充至2.0ml。 5.操作步骤 5.1 样品制备 全部实验过程应避光。 称取100g鲜样，加100g偏磷酸-乙酸溶液，倒入打碎机内打成匀浆，用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。如呈红色，即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释，若呈黄色或兰色，则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释，使其pH为1.2。匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定。当样品液含量在40~100μg/ml之间，一般取20g匀浆，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml，过滤，滤液备用。 5.2 氧化处理:分别取样品滤液及标准使用液各100ml于带盖三角瓶中，加2g活性炭，用力振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即样品氧化液和标准氧化液，待测定。 5.3 各取5ml标准氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明"标准"及"标准空白"。 5.4 各取5ml样品氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明"样品"及"样品空白"。 5.5 于"标准空白"及"样品空白"溶液中各加5ml硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动15min，用水稀释至50ml，在4?冰箱中放置2h，取出备用。 5.6 于"样品"及"标准"溶液中各加入5ml50%乙酸钠溶液，用水稀释至50ml，备用。 5.7 荧光反应 取"标准空白"溶液，"样品空白"溶液及(5.6)中"样品"溶液各2ml，分别置于10ml带盖试管中。在暗室中迅速向各管中加入5ml邻苯二胺，振摇混合，在室温下反应35min，用激发光波长338nm、发射光波长420nm测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其直线回归方程供计算时使用。 6. 计算 X=(c×V/m)×F×(100/1000) 式中:X-----样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g; c------由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度，μg/ml; m-----试样质量，g; F------样品溶液的稀释倍数; V------荧光反应所用试样体积，ml。 例: 测定每一制备溶液的荧光强度。用标准溶液每ml含2.5μg、5.0μg、7.5μg及10.0μg，各标准浓度管读数减去相应的标准空白读数的各平均值做标准曲线。 由样品液读数减去样品液空白读数之值，从标准曲线上查得相应的抗坏血酸(μg/ml)，按取样量及稀释率计算样品中抗坏血酸的含量。 如:取制备好的辣椒样品2.138g，稀释到100ml，氧化后分别取10ml滤液稀释到50ml 样品读数为23.34，样品空白读数为3.188，样品读数减去样品空白读数为20.152，查荧光标准曲线相当标准抗坏血酸的2.23μg。 2.23×100× 50× 100 ---------------- --------= 52(mg/100g) 2.138× 10 ×1000 7. 注意事项 7.1 大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用偏磷酸-醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素C。 7.2 某些果胶含量高的样品不易过滤，可采用抽滤的方法，也可先离心，再取上清液过滤。 7.3活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，但它也有吸附抗坏血酸的作用，故活性炭用量应适当与准确，所以，应用天平称量。我们的实验结果证明，用2g活性炭能使测定样品中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型，其吸附影响不明显。 2，4-二硝基苯肼法 1(原理 总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸。样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4-二硝基苯肼作用生成红色脎，脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。 2(适用范围 GB12392-90 本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。 3. 仪器 3.1恒温箱:37?0.5? 3.2可见-紫外分光光度计 3.3打碎机 4(试剂 本实验用水均为蒸馏水，试剂纯度均为分析纯。 4.1 4.5mol/L硫酸:谨慎地加250ml硫酸(比重1.84)于700ml水中，冷却后用水稀释至1000ml。 4.2 85%硫酸:谨慎地加900ml硫酸(比重1.84)于100ml水中。 4.3 2%2，4-二硝基苯肼溶液:溶解2g 2，4-二硝基苯肼于100ml4.5mol/L硫酸内，过滤。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。 4.4 2%草酸溶液:溶解20g草酸于700ml水中，稀释至1000ml。 4.5 1%草酸溶液:稀释500ml 2%草酸溶液到1000ml。 4.6 1%硫脲溶液:溶解5g硫脲于500ml 1%草酸溶液中。 4.7 2%硫脲溶液:溶解10g硫脲于500ml1%草酸溶液中。 4.8 1mol/L盐酸:取100ml盐酸，加入水中，并稀释至1200ml。 4.9 活性炭:将100g活性炭加到750ml 1mol/L盐酸中，回流1~2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子(Fe3+)为止，然后置于110?烘箱中烘干。 4.10 标准 (1)抗坏血酸标准溶液(1mg/ml):溶解100mg纯抗坏血酸于100ml 1%草酸溶液中。 (2)标准曲线绘制 加1g活性炭于50ml标准溶液中，摇动1min，过滤。 取10ml滤液放入500ml容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度。抗坏血酸浓度为20μg/ml。 取5，10，20，25，40，50，60ml稀释液，分别放入7个100ml容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1，2，4，5，8，10及12μg/ml。 按样品测定步骤形成脎并比色。 以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度(μg/ml)为横坐标绘制标准曲线。 5. 操作步骤 5.1样品制备 全部实验过程应避光。 5.1.1鲜样制备:称100g鲜样和100g2%草酸溶液，倒入打碎机中打成匀浆，取10-40g匀浆(含1-2mg抗坏血酸)倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。 5.1.2干样制备:称1-4g干样(含1-2mg抗坏血酸)放入乳钵内，加入1%草酸溶液磨成匀浆，倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。 5.1.3将上述两液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。 5.2氧化处理:取25ml上述滤液，加入0.5g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10ml此氧化提取液，加入10ml 2%硫脲溶液，混匀。 5.3呈色反应 5.3.1于三个试管中各加入4ml稀释液。一个试管作为空白，在其余试管中加入1.0ml 2%2，4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放入37?0.5?恒温箱或水浴中，保温3h。 5.3.2 3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后加入1.0ml 2%2，4-二硝基苯肼溶液，在室温中放置10~15min后放入冰水内。其余步骤同样品。 5.3.3 85%硫酸处理:当试管放入冰水后，向每一试管中加入5ml85%硫酸，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。 5.3.4 比色:用1cm比色杯，以空白液调零点，于500nm波长测吸光值。 6. 计算 同荧光法。 7. 注意事项 7.1 大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用2%草酸溶液制成匀浆以保存维生素C。 7.2 若溶液中含有糖，硫酸加得太快，溶解热会使溶液变黑。 7.3 试管自冰水中取出后，颜色会继续变深，所以，加入硫酸后30分钟应准时比色。 碘滴定法 一、目的及原理 本试验是利用碘酸钾做氧化剂。即在一定量的盐酸酸性试液中加碘化钾—淀粉指示剂，用已知浓度的碘酸钾滴定。当碘酸钾滴入后即释放出游离的碘，此碘被维生素C还原，直至维生素C完全氧化后，再滴以碘酸钾液时，释放出的碘因无维生素C的作用，可使淀粉指示剂呈蓝色，即为中点，其反应如下: KIO3 + 5KI + 6HCl?6KCl + 3H2O + 3 I2 二、药品与器材 柑橘、鲜枣、洋葱、甘蓝、辣椒等。 碘酸钾、碘化钾、淀粉，2%盐酸。 研钵、烧杯、100ml容量瓶、0.5、2、5ml移液管、滴定管、漏斗、纱布、分析天平。 三、操作与步骤 1.试剂制备 (1)0.5%淀粉液:称取可溶性淀粉0.5g，用蒸馏水调成浆状，注入100ml蒸馏水，煮沸至透明状，冷后用棉花过滤。 (2)0.001N KIO3液:精确称取KIO3 0.3568g(KIO3预先在102?烘2小时，在干燥器中冷却备用)， 准确配成1000ml，得到0.01N KIO3液。再稀释10倍即为0.001N。 2.样品试液的制备: 将果蔬样品洗净，用纱布拭干其外部所附着的水分，若样品清洁可不必洗涤。样品若为大型果蔬，先纵切为4―8等分，取其20―30g为一份，除去不能食用部分，切碎。若为大型叶菜，沿中脉切分为二分，取其一分切碎。称取20g作分析用。 将称取的样品放研钵中，加2%的盐酸5―10ml，研磨至呈浆状。小心无损地移研钵中样品于100ml容量瓶中，研钵用2%盐酸液冲洗后，亦倒入量瓶中，并加2%盐酸至100ml，充分混合。用清洁干燥二层纱布过滤入干燥的烧杯中，滤液作测定用。 3.样品液的测定: 在50ml的烧杯中，用移液管注入1%的KI0.5ml，0.5%淀粉液2ml，以及上述制得的试液5ml;再加蒸馏水至总体积10ml(加2.5毫升)。用0.001N KIO3液滴定，要一滴一滴加入，并时时摇动烧杯，至微蓝色不褪为终点(一分钟不褪为止)。记录所用KIO3液毫升数。 同上法再测定3次。用各次测定的平均值，计算维生素C含量。 计算公式: V X 0.088 b W = ―――――――― X — X 100 B a W = 100克样品含的抗坏血酸毫克数。 V = 滴定样品所用的KIO3毫升数。 0。088 = 1毫升0.001N 碘酸钾溶液相当的抗坏血酸的量(mg/ml)。 B = 滴定时所用样品溶液毫升数。 b = 制成样品液的总毫升数。 a = 样品的克数。 四、结果与计算 1.将测定的数据填入下列中 样品名称 样品重量(g) 样品液总体积(ml) 滴定时用样品液的量(ml) 滴定样品所用KIO3量(ml) 维生素C含量(mg/100g) 1 2 3 4 平均 2.列出计算式并计算结果 其实测定Vc方法有很多种，还有磷钼酸铵法，间接碘量法等等。其中荧光法和2，4,二硝基苯肼法为国标方法。常用的一般为上面4种。