叶绿素a测定

叶绿素a测定 实验三 富营养化湖中藻量的测定(叶绿素a法) 一、实验目的 富营养化湖由于水体受到污染，尤以氮磷为甚，致使其中的藻类旺盛生长。此类水体中代表藻类的叶绿素a浓度常大于10微克/升。 本实验通过测定不同水体中藻类叶绿素a浓度，以考查其富营养化情况。 二、器材与用品 1、分光光度计(波长选择大于750nm，精度为0.5,2nm)。 2、比色杯(1cm;4cm)。 3、台式离心机(3500r/min) 4、离心管(15ml具刻度和塞子);冰箱 5、匀浆器或小研钵。 6、蔡氏滤器;滤膜(0.45微克，直径47mm)。 7、真空泵(最大压力不超过300kpa)。 8、MgCO悬液:lg MgCO细粉悬于100ml蒸馏水中。 33 9、90,的丙酮溶液:90份丙酮，10份蒸馏水。 10、水样:两种不同污染程度的湖水水样各2L. 三、方法和步骤 1、按浮游植物采样方法，湖泊、水库采样500ml，池塘300ml。采样点及采水时间同“浮游植物”。 2、清洗玻璃仪器:整个实验中所使用的玻璃仪器应全部用洗涤剂清洗干净，尤其应避免酸性条件下而引起的叶绿素a分解。 3、过滤水样;在蔡氏滤器上装好滤膜，每种测定水样取50,500ml减压过滤。待水样剩余若干毫升之前加入0.2ml MgCO3悬液、摇匀直至抽干水样。加入MgCO可增进藻细胞滞留在滤3 膜上，同时还可防止提取过程中叶绿素a被分解。如过滤后的载藻滤膜不能马上进行提取处理，应将其置于干燥器内，放冷(4?)暗处保存，放置时间最多不能超过48小时。 4、提取;将滤膜放于匀浆器或小研钵内，加2,3ml90,的丙酮溶液，匀浆，以破碎藻细胞。然后用移液管将匀浆液移入刻度离心管中，用5ml90,丙酮冲洗2次，最后向离心管中补加90,丙酮，使管内总体积为10ml。塞紧塞子并在管子外部罩上遮光物，充分振荡，放冰箱避光提取18,24小时。 5、离心:提取完毕后，置离心管于台式离心机上3500r/min，离心10min，取出离心管，用移液管将上清液移入刻度离心管中，塞上塞子，3500r/min在离心10min。正确记录提取液的体积。 6、测定光密度:藻类叶绿素a具有其独特的吸收光谱(663nm)，因此可以用分光光度法测其含量。用移液管将提取液移入1cm比色杯中，以90,的丙酮溶液作为空白，分别在750、663、645、630nm波长下测提取液的光密度值(OD)。注意:样品提取的OD值要求在0.2与1.0之间，如不在此范围663 内，应调换比色杯，或改变过滤水样量。OD小于0.2时，应663 该用较宽的比色杯或增加水样量;OD大于1.0时，可稀释提663 取液或减少水样滤过量，使用1cm比色杯比色。 7、叶绿素a浓度计算:将样品提取液在663、645、630nm波长下的光密度值(OD OD OD)分别减去在750nm下的光663645630 密度值(OD),，此值为非选择性本底物光吸收校正值。叶绿750 素a浓度计算公式如下: (1)样品提取液中的叶绿素a浓度Ca为: Ca(微克/升),11.64(OD,OD),2.16(OD,OD)663750645750+0.1(OD,OD 630750 (1) 水样中叶绿素a浓度为: 叶绿素a(微克/升),Ca×v/(V×L) 2) ( 叶绿素a(微克/升),Ca×v/V×L Ca:样品提取液中叶绿素a浓度(微克/升) v :90,丙酮提取液体积(ml) V:过滤水样的体积(L) L:比色杯宽度(cm) 四、实验 将测定结果记录于表4,1中 表4,1 测定结果 叶绿素a 水样 OD OD OD OD (微克/750663645630 升) A湖水 B湖水 根据测定结果，参照表4,1中指标被测水样的富营养化程度。 表4,2 湖泊富营养化的叶绿素a评价 类 型 指 标 贫营养型 中营养型 富营养型 叶绿素a(微克/升) ,4 4,10 10,150 五、思考题 1、比较两种水样中的叶绿素a浓度，通过本实验你的结论是什么, 2、如何保证水样叶绿素a浓度测定结果的准确性,主要应注意哪几个方面的问题,