单增李斯特菌基因组DNA提取方法比较

单增李斯特菌基因组DNA提取方法比较 单增李斯特菌基因组DNA提取方法比较 江苏农业科学2011年第39卷第2期 张茹,吕淑霞,祝儒刚,等.单增李斯特菌基因组DNA提取方法比较[J].江苏农业科学,2011,39(2):67—69 单增李斯特菌基因组DNA提取方法比较 张结,吕淑霞,祝儒刚,徐斌,金雪花 (沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳110866) 摘要:为了选择一种简单,快速,有效的单增李斯特菌基因组DNA的提取方法,采用溶菌酶一蛋白酶K法,氯仿/ 异戊醇法,液氮冻融法提取单增李斯特菌基因组DNA,利用PCR扩增结果判断所得DNA样品的质量.结果为,3种不 同方法均能扩增出234bp条带,溶菌酶一蛋白酶K法提取的DNA检出限最低,为1.25×10CFU/mL.结论为, 溶菌酶一蛋白酶K法提取的DNA模板进行PCR扩增检出限最低,该方法提取的基因组DNA适用于PCR扩增和其他 分子生物学研究. 关键词:单增李斯特菌;DNA提取;聚合酶链反应(PCR) 中图分类号:Q78文献标志码:A文章编号:1002—1302(2011)02—0067—02 单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是一种短小的革兰 氏阳性无芽孢杆菌,属人畜共患病的致病细菌,临床上主要导 致脑膜炎,败血症和孕妇流产等.由于其高致病性,在国内外 食品安全检测中日益受到重视.随着分子生物学的发展, 应用PCR方法对单增李斯特菌进行检测可以缩短检测时间, 提高检测效率.提取高质量的基因组DNA是进行食品安全 性检测的前提,目前,从菌体中提取单增李斯特菌基因组 DNA的方法众多,但由于提取机理和的差别,获得DNA 的量及纯度各不相同,导致在后续试验中PCR扩增,DNA测 序等应用效果的不同. 本研究采用了3种不同的DNA提取方法,针对单增李斯 特菌的致病性基因片段设计1对引物,对不同的方法提取出 的DNA进行PCR扩增,比较灵敏度,选择出一种简单,快速 且灵敏度高的方法,为进一步进行单增李斯特菌的PCR分子 检测研究提供指导. 1与方法 1.1材料 1.1.1菌种单增李斯特菌菌株为ATCC19111,其他 菌株均为笔者所在实验室保存. 1.1.2试剂TaqDNA聚合酶,dNTPs,10XPCRBuffer(含 1.5mmol/LMg"),LoadingBuffer,l000bpMarker,TaKaRa 公司;PCR引物选择种特异性hly基因为目的基因,根据文献 设计,由TaKaRa公司合成,引物序列为F:5一CGGAGGTFC— CGCAAAAGATG一3,R:5一CCTCCAGAGTGATCGATGTF一 3,引物长度为2Obp,退火温度58?,扩增片段长度为 234bp.其他试剂均为国产分析纯. 1.1.3仪器PCR仪,TECHNE公司;凝胶成像系统,伯乐 收稿日期:2010—12—11 基金项目:教育部留学回国人员基金(编号:2006—331);沈阳市科技 局基金(编号:090009). 作者简介:张嚣(1984一),男,硕士研究生,主要研究方向为食品安 全性检测.E—mail:ca—zhangzhe@yahoo.com.cn. 通信作者:吕淑霞,女,博士,教授,博导,研究方向为微生物生物化学 与分子生物学.E—mail:lushuxia@hotmail.COB. 公司. 1.1.4培养基胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤培养基(TSB— YE):胰蛋白胨15g,大豆蛋白胨5g,氯化钠5g,酵母膏6g, 蒸馏水1000mL,pH值7.4. 1.2方法 1.2.1菌株培养单增李斯特菌接种于胰酪胨大豆酵母浸 膏肉汤培养基中,37?过夜增菌培养. 1.2.2基因组DNA提取方法 1.2.2.1溶菌酶一蛋白酶K法(1)取过夜培养的菌液 500L加入1.5mL离心管中,12000r/min离心10min得菌 体,弃上清液;(2)95L无菌蒸馏水重悬,加入4溶菌酶 (50mg/mL),用枪头混匀,37?温浴15min;(3)加入1IxL 蛋白酶K(20mg/mL),振荡数秒,置于58?恒温水浴锅内孵 育50min;(4)95?加热8min,使酶失活;(5)12000r/min 离心5min,取上清液备用. 1.2.2.2氯仿/异戊醇法(1)取过夜培养的菌液500txL 加入1.5mL离心管中,12000r/min离心10min得菌体,弃 上清液;(2)100txL无菌蒸馏水重悬DNA,加入100p,LTris一 酚,轻轻混匀后,12000r/min离心5min,去上清液转移至新 离心管中;(3)加入100L氯仿/异戊醇,颠倒混匀后, 12000r/min离心5min,转移上清液至新离心管中;(4)加入 预冷的2倍体积的无水乙醇,混匀后, 12000r/min离心10min,弃上清液;(5)加入40无菌蒸 馏水,一20?保存备用. 1.2.2.3液氮冻融法(1)取过夜培养的菌液500加入 1.5mL离心管中,12000r/min离心10min得菌体,弃上清 液;(2)加入95L无菌蒸馏水混匀,放入100?沸水中静置 1min,立即转移至液氮中冷冻2min,反复5次;(3) 12000r/min离心5min,取上清液备用. 1.2.3PCR检测以提取的基因组DNA为模板,用单增李 斯特菌hty基因的特异引物进行PCR扩增.反应体系为 30:模板DNAlL;DNATaq聚合酶(5U/o~L)0.3ixL; 10×PCRBuffer5IxL;dNTP(2.5mmoL/L)lIxL;上,下游引物 (10pmo~L)各1txL;灭菌去离子水20.7L.循环参数为: 95?预变性2min,94oC变性50S,58?退火30S,72oC延伸 30S,30个循环,最终72?延伸5min.PCR产物用2%琼脂 一 68一江苏农业科学2011年第39卷第2期 糖凝胶电泳检测. 1.2.4特异性检测取单增李斯特菌,金黄色葡萄球菌,热 带假丝酵母,伤寒沙门氏菌,芽孢杆菌,副溶血弧菌,创伤弧 菌,大肠杆菌纯培养物制备细菌基因组DNA,进行PCR扩增 反应与电泳检测分析. 1.2.5灵敏度分析分别取10倍梯度稀释的菌液1mL进 行平板菌落计数,各稀释度至少重复3次,取每个平板上菌落 数在30—300个进行计数.最后取其平均值作为纯培养菌液 浓度;取10倍梯度稀释的菌液500IxL,按照上述3种方法提 取基因组DNA,进行PCR检测. 2结果与分析 2.1单增李斯特茵的特异性检测 单增李斯特菌的基因组DNA能扩增出234bp的特异性 片段,非单增李斯特菌没有特异条带产生(图1).说明本试 验建立的PCR快速检测方法具有良好的特异性. Ml2345678 000bp 700bp 500bp 400bp 300bp 200bp 100bp M一1000bpmarker;l一单增李斯特菌:2—金黄色葡萄球菌: 3—热带假丝酵母;4一伤寒沙门氏菌;5一芽孢杆菌;6一副溶 血弧菌;7—创伤弧菌;8一大肠杆菌 . 图lPCR特异性检验结果 2.2不同方法提取基因组DNA的PCR检测灵敏度 平板计数得出过夜培养菌液菌落数为1.25×10 CFU/mL.单增李斯特菌为革兰氏阳性菌,细胞壁较厚,常规 方法不易去除细胞壁,因此不同方法提取的DNA质量不同, 用它们做模板进行PCR扩增的结果也不相同.分别用3种 方法对梯度稀释的菌液提取基因组DNA后进行PCR检测, 如图2,图3,图4所示. Ml2345678 1000bp 700bp 500bp 400bp 300bp 200bp 100bp M—l000b口marker;l,2,3,4,5,6,7,8分别为1.25x10, 1.25x10,1.25~106, 1.25~10,J.25xJ0,1.25x10,1.25x10, 1.25~10CFU/mL菌液 图2溶菌酶一蛋白酶K法提取模板DNA经PCR扩增结果电泳 用特异引物协对3种方法提取的基因组DNA进行 PCR扩增,扩增后的电泳图谱可以看出3种方法提取的DNA 模板都能扩增出条带,并且产物条带亮度随着模板浓度的降 低而减弱.但溶菌酶一蛋白酶K法提取的基因组DNA经 M—l000bpmarker;1,2,3,4,5,6,7,8分别为1.25x10, 1.25x10,J.25x1o6, 1.25x10,1.25~10,1.25~10,1.25xlos , 1.25×10CFU/mL菌液 图3氯仿/异戊醇法提取模板DNA经PCR扩增结果电泳 000bp 700bp 500bp 400bp 300bp 200bp 100bp Ml2345678 M一1000bpmarker;l,2,3,4,5,6,7,8分别为1'.25~10, 1.25x10,1.25~10,1.25x10,1.25x10,1.25x10,1.25x10, 1.25xJ0CFU/mL菌液 图4液氨冻融法提取模板DNA经PCR扩增结果电泳 PCR扩增灵敏度可以达到1.25x10CFU/mL,而氯仿/异戊 醇法和液氮冻融法提取的基因组DNA经PCR扩增后敏度 为1.25x10CFU/mL.酶化法提取的基因组DNA作为模板 灵敏度高,重复性好,结果理想. 3讨论 比较了3种不同的基因组DNA提取方法,结果表明,溶 菌酶一蛋白酶K提取的基因组DNA经PCR扩增灵敏度高于 液氮冻融法和氯仿/异戊醇法,达到了1.25×10CFU/mL,后 2种方法提取的基因组DNA经PCR扩增后灵敏度都是1.25 x10CFU/mL,与国内外的报道一致.究其原因,单增李 斯特菌为革兰氏阳性菌,细胞壁厚,常规方法难以破碎细胞 壁,或者细胞壁破碎不完全,不能使得细胞中DNA释放出 来.而溶菌酶一蛋白酶K法由于使用了溶菌酶来破坏细 菌的细胞壁以及用蛋白酶K降解随着细胞破裂而释放出来 的蛋白质,而在PCR检测中蛋白质会影响到检测结果的灵敏 度,因此溶菌酶一蛋白酶K法提取的基因组DNA比其他2种 方法灵敏度高. 从3种提取基因组DNA方法的操作程序上看,溶菌酶一 蛋白酶K法只要加入2种酶,不需要复杂的操作.而氯仿/ 异戊醇法步骤复杂,且要用到有毒或有腐蚀性的有机试剂,对 试验人员易造成伤害;液氮冻融法的步骤简单,可以满足一般 PCR反应的要求,但是对于食品安全性检测要求灵敏度较高 的试验,由于其步骤简单,没有相应去除蛋白质的步骤,因此 灵敏度不高., 本研究中获得的结果都是经过3次以上的重复试验,这 (下转第69页) 江苏农业科学2011年第39卷第2期一69一 张婷,刘双青,郭淑倩,等.油茶AFLP分子标记体系的建立[J].江苏农业科学,2011,39(2):69—71 油茶AFLP分子标记体系的建立 张婷,刘双青,郭淑倩,姚瑶 (1.荆楚理工学院生物工程学院,湖北荆门448000;2.武汉生物工程学院生物技术系,湖北武汉430415) 摘要:以油茶DNA为材料,对AFLP分析中的基因组DNA酶切用量,连接液稀释倍数,预扩增产物稀释倍数, Mg浓度等4个因素进行优化比较.结果表明,用oRI和MseI双酶切500ng基因组DNA效果最好,酶切产物加 接头后稀释10倍进行预扩增效果较好.在Mg浓度为50Ixmol/L时,预扩增产物稀释90倍作为选择性扩增模板,扩 增效果最佳.此体系的建立为AFLP在油茶遗传多样性研究中的应用打下了基础. 关键词:油茶;AFLP;酶切 中图分类号:s794.4文献标志码:A文章编号:1002—1302(2011)02—0069—03 AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,扩增片段 长度多态)是RFLP和PAPD相结合的一种标记技术,它主要 对基因组DNA限制性酶切后,对酶切片段进行选择性扩增, 不同个体中存在碱基突变会增加或减少酶切位点,造成酶切片 段的长度不等,产生多态性.AFLP由于检测效率高,可靠性 好,重复性高,多态性高等特点而受到遗传育种学家的青睐,被 广泛用于动植物分子标记辅助育种的相关领域j.油茶 (Camelliaoleifera)系山茶科山茶属油料植物,是我国南方的特 有树种,与油棕,油橄榄,椰子并称为世界四大木本油料树 种.油茶的主要产品是茶油,具有很高的社会经济价值.油 茶与其他茶科植物相比,分子水平的研究开展较晚.本研究对 油茶AFLP分析体系中的关键因素进行了优化,为AFLP分子 标记技术在油茶遗传多样性研究中的应用打下基础. 1材料与方法 1.1材料 油茶植株幼嫩叶片采自湖北武汉新洲地区,置于事先准 备好的冰盒中带回实验室,一2O?长期保存. 收稿日期:2010—06—02 基金项目:湖北省教育厅项目(编号:B20094001);武汉市教育局项 目(编号:2008K080). 作者简介:张婷(198O一),女,湖北襄樊人,硕士,讲师,研究方向为 生物化学与分子生物学.E—mail:ztxianyun@126.com. 1.2试剂 试验采用的限制性内切酶EcoRI,MseI为NEB公司产 品.T4DNA连接酶,TaqDNA聚合酶,dNTPs和DL2000 marker购自宝生物工程(大连)有限公司,本试验中的EcoRI 接头,MseI接头,预扩增引物,选择性扩增引物由上海生工生 物工程技术服务公司合成(表1). 表1试验中的AFLP引物 1.3方法 1.3.1基因组DNA的提取采用改良的CTAB法提取基因 组DNA,用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取效果,并将基因组 DNA稀释至100ng/IxL,保存备用. 1.3.2基因组DNA的酶切反应基因组DNA的双酶切反 应总体积20,基因组DNA用量设5个梯度:100,300,500, 700,900ng,EcoRI限制性内切酶(20U/L)0.5ILL,MseI (上接第68页) 表明建立的检测方法有较好的重复性,所提取出来的模板 DNA适用于食品安全性快速检测的需求. 参考文献 [1]GrayMJ,ZadoksRN,FortesED,eta1.Listeriamonocytogenesiso. 1atesfromfoodsandhumansformdistinctbutovedappingpopulations [J].ApplEnvironMicrobiol,2004.70:5833—5841. 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