酵母菌种类鉴定论文分子生物学技术论文：浅谈葡萄酒发酵过程中酵母种类的鉴定

酵母菌种类鉴定分子生物学技术论文：浅谈葡萄酒发酵过程中酵母种类的鉴定 酵母菌种类鉴定论文分子生物学技术论文:浅谈葡萄酒发酵 过程中酵母种类的鉴定 摘要在葡萄酒酿造过程中，酵母菌是最重要的一类微生物，它的种群结构及变化决定了葡萄汁发酵的成败，而且对葡萄酒的风味和品质有重要影响。因此，研究葡萄酒发酵过程中酵母菌种类和菌群的动态变化，对在发酵过程中合理调控微生物，发挥各类酵母菌的优点，有很大的积极作用。近年来，随着生物技术的不断进步，分子生物学技术鉴定酵母菌种的已逐步取代传统的依靠酵母生理生化特征和形态的鉴定方法。本文主要介绍了wl营养培养基鉴定法和分子生物学鉴定法。 关键词酵母菌种类鉴定;葡萄酒;分子生物学技术 1wl培养基 传统的酵母种群鉴定主要将其生理特征和形态特征作为鉴定指标，该方法的工作量大、周期长、操作繁杂，而且有时鉴定结果的重复性差。wl鉴别培养基主要依据菌落颜色的反应及形态进行区分，可用于鉴定一些常见的葡萄酒相酵母。该方法鉴定酵母菌相对比较简便、快速，而且分类结果稳定。材料和方法如下: 1)菌种。 2)培养基及试剂。?yepd培养基:酵母浸粉1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，琼脂2.0%。外加100mg/l的氯霉 素(排除筛选过程中细菌的干扰)。?wl营养培养基。 3)试验方法。?酵母菌的分离及纯化。将发酵车间未接入活性干酵母的葡萄醪置于预先灭菌的容器中，加入40mg/l的二氧化硫，在发酵车间进行自然发酵，于发酵的前、中、后期分别取样，梯度稀释涂yepd平板，28摄氏度下培养。3天后，随机抽取10-15个菌落。?酵母菌的初步分类鉴定。将保藏的菌种进行活化，通过划线法接种于wl营养培养基中，放在霉菌培养箱(28摄氏度)中培养5天后观察，菌落的形态和颜色。?结果与讨论。wl培养基可对葡萄酒自然发酵过程中出现的大多数典型的酵母菌种进行区分，主要根据菌落的颜色及形态。主要的葡萄酒相关酵母菌在wl营养培养基上生长的菌落颜色及其形态如表1所示。 2分子生物学鉴定方法 1)dna限制性片段多态性分析(pcr-rflp)。dna限制性片段多态性分析(pcr-rflp)是一项基于dna和分子杂交的技术，它的特异性很强。在葡萄酒相关酵母菌的鉴定过程中广泛使用的是5.8s-its区域的pcr-rflp。酵母5.8s rrna基因及两侧的转录间隔区(internal transcribed spacer，its)可以作为鉴别酵母菌种的分类依据，它具有显著的种间差异性。 2)脉冲电泳核型分析(pfge)。脉冲电场凝胶电泳的原理是在琼脂糖凝胶中，用电泳分离出整的酵母染色体dna分 子，然后测定酵母细胞染色体的条数及大小。研究表明，脉冲电泳核型分析为酵母属(saccharomyces)的种内鉴定作出了巨大贡献，而且它是一种快捷、有效的鉴定方法。 3)随机扩增多态性dna。1990年，加利福尼亚生物研究所welsh和美国杜邦公司科学家williams领导的两个研究小组几乎同时发明了随机扩增多态性dna(rapd)。它的原理是以pcr技术为基础利用10个左右碱基的随机引物，对整个基因组的dna进行扩增，得到很多片断，然后再利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)检测个体间扩增出的片断的多态性，这样就可以辨别出菌株间基因组dna内核苷酸序列存在的细微差异。 4)核糖体dna序列分析。葡萄酒相关酵母的鉴定过程中最常用的是rrna基因(rdna)及转录间区(its)的序列，其中包括5.8s rdna 、18s rdna、26s rdna的dl/d2、its。这些序列都能在genbank/embl/ddbj等国际核酸序列数据库中找到，因此，对特定基因区域的序列的对比，能够准确地鉴定出葡萄酒相关酵母的种类。 5)其他分子鉴定方法。近些年来，分子生物技术发展迅速，鉴定葡萄酒相关酵母菌种的方法也不断发展，出现了很多方便快捷的新的鉴定方法，如实时pcr技术(real time pcr)。这是一项以稳定遗传特性的技术为基础的方法，它可以特异性地鉴定酵母菌的种类。hierro等人于2007年指出， 实时pcr技术无需酵母菌种的预培养就可以达到鉴定的目的，是一种快捷有效的鉴定方法。除此之外，arisa、t-rflp及微卫星分子标记技术和dna重组探针的指纹图谱技术对葡萄酒相关酵母菌种的鉴定也有很大贡献。 3总论 wl营养培养基对葡萄酒发酵过程中的大多数菌株有很好的鉴别作用，可以用于酵母菌的鉴定及接种发酵中可能的杂菌污染的监测。分子生物学技术对鉴定葡萄酒相关酵母菌种也有很大作用，为日后开发和利用相关酵母资源，酿制优质特色葡萄酒提供了理论基础。随着科技的不断更新进步，更加准确、更高效、更快捷和廉价的酵母菌种鉴定手段将会得到发展。 参考文献 [1]杨雪峰,苏龙,刘树文.利用wl营养培养基鉴定葡萄酒中相关酵母[j].2006,4. [2]卢君,李艳.分子生物学技术在葡萄酒相关酵母菌分类鉴定中的应用及研究进展[j].2009,6. [3]王会会,刘天明,王可,等.烟台干红葡萄酒发酵过程中酵母种类鉴定[j].2011,1. [4]王泽举,刘延琳,刘爱国,等.新疆葡萄酒自然发酵过程酵母菌的种类和动态变化[j].2008,5 [5]王慧,张立强,刘天明,等.葡萄果粒表皮酵母菌多样 性研究[j].2008,1.