【doc】高碘喂养小鼠室旁核一氧化氮合酶阳性神经元的变化

【doc】高碘喂养小鼠室旁核一氧化氮合酶阳性神经元的变化 高碘喂养小鼠室旁核一氧化氮合酶阳性神 经元的变化 中国临床康复第卷第2期2006—01—15出版 ChineseJournalofClinicalRehabilitation,January152006I/o1.10『o.2 高碘喂养小鼠室旁核一氧化氮合酶阳性神经元的变化轴 杨长春,韩盈,张松筠,郝宏,尹桂山,朱惠民 97 ? 基础研宪? '武装警察部队总医院干一科,北京市100039;河北医科大学第二医 院内分泌科.河北省石家庄市050000;承德市中心医院功能科,河北 省承德市067000:河北医科大学,河北省石家庄市050000 杨长春?,女,1963年生,江苏省东台市人,汉族,2002年河北医科大学 毕业,博士,主要从事心,脑疾病的基础和临床研究工作. Yangchangchun99@sina.com 河北省自然科学基金资助项目(398285) 中图分类号:R574.62文献标识码:A文章编号:l67l一5926(2006)02-0097-03 收稿15t期:2oo5一Il一24修回15t期:2005一l2一l5(05—50一Il一857l/J?X) Effectofhighiodineonthenitricoxidesynthasepositiveneu- ronsinparaventricularnucleusofmice YangChang—chunHanYingZhangSong-yun7.HaoHong.'tinGui? sha#,Zhuhui—min 'FirstDepa~mentofCadre.GeneralHospitalofChinesePeople'sArmed PoliceForces.Beijing100039,China;DepartmentofEndocrine,Second HospitalofHebeiMediealUniversity.Shijiazhuang050000.Hebei Province.China;ChengdeCentralHospita1.Chengde067000.Hebei Province.China;HebejMedicalUniversity.Shijiazhuang050000.Hebei Province.China YangChang—chun?.Doctor.FirstDepartmentofCadre.GeneralHospital ofChinesePeople'sArmedPoliceForces.Beiiingl00039,China Yangchangchun99@sina.com Supportedby:theNationalNaturalFoundationofHebeiProvince.No. 398285* Received:2005..11..24Accepted:2005--12--15 Abstract AIM:ToobservetheeffectofhighiodineonnitricoxidesynthasefNOS1 positiveneuronsinparaventricularnucleusfPVN)ofmiceandexplorethe efclofhighiodiBeoncentralnervoussystem. METH0DS:TheexperimentwasconductedinHebeiMedicalUniversity fromJanuarytoOctober2004.SixteenweaningKunmingmicewereran— domlydividedintoproperiodinegroupandhighiodinegroupwith8mice ineat?hgroup.Mice;i1thetwogroupswerefedwithdistilledwatercon- tainingiodine50g/Land3000g/Lrespectively)rsjxmonths.Atthe l80dayofexperiment.micewerekilledbycuttingoffheads,thyroid glandsweremadeintopathologicalsection.soastoI)eobservedunder hematoxylin-eosinstaining.1ightmicroscopeThyroidglandwereobtained andthemorphologicchangeswasobservedunderthereconstructionof goitermodelsucceeded.Nicotinamideadenosinedinucleotidephosphatedi. aphorasefNADPH.d1histochemicalmethodwasusedtooservetheeffectof highiodineonNOSpositiveneuronsiuhypothalamicPVNofmice. RESULTS:Nosubjectdicelabnormallyintheexperiment.allofthemwere involvedintheanalysisofresults.?Undermicroscope,sizeandshapeof thyroidfolliclesinthecontrolgroupweredifierent,andthereweremoderate pinkcolloidinthefoIlk?ularcavities.thefollicleswerecubicorcylinderand inthecenterofcellstheywereroumlorovalWithmoderatecytoplasm.but bloodcapillarieswereplentiful;ThedeoxidizedNADPH_(1positiveneurons distributionwere(l.1ikearoundPVN,andthecellularshapeswerepoly. gon.fusiform.ova1.theendochylemawasfuUwithI)luedeepstainedand distincteephyma.andthereweremuchstainedfilters.(2)Thyroidfollielesin thehigh—iodinegroupunderlightmicroscopedilatedobviously,andthere wereabundantapplanatusstaine~1pinkcolloidfollicularepithelialcellsin— sidethecavity.whk?hwereinfusif1)rmshapewithfollicularstromade— creased;OnlysporadicNADPH—dpositiveneuronscouldbeseeninPVN. andtheyweremainlyinfusifoFmandovalshapewithlightstainedcyto— plasmandno—stainednucleus,theecphymawasnotsignificant,fewposi— tirefiberscouldbeseen.(3)ThepositiveeelldencitvofNOSinthePVNof gh—iodinegroupwaslowerthanthatintheproperiodinegroup.andthe differencesweresignificant【(24+2.7),(81.5+3.5)/0.01mm2,t=2.306-3.355, P<0.011. CONCLUSION:Hig}1iodinecancausethedensityofNOSstainedposi- tiveneuronsinPVNofmicedecreasedobviouslywithlighterstainand shortereephyma.HighiodinecanalsoaffectthesynthesisofNOSbyinflu— encingthechangesofNOSpositivecellsinhypothalamusPVNofmice, thusaffectthecentralneurologicalfunction. YangCC.HanZhangSY,HaoH.YinGS.ZhuHMEffeclofhighiodineonlhe nitricoxidesynlhasepositiveneuronsinparaventricularnucleusofmiceZhor~,o LinchuangKanff&2006.1ol2l:97—9lChinal 杨长春.韩盈.张松筠,郝宏,尹桂山,朱惠民高碘喂养小鼠室旁核一氧化氮合酶 阳性神经元的变GUI中国临床康复,2006,10(21:97-9buwwzglckfcoml 摘要 目的:观察高碘对小鼠室旁核一氧化氮合酶阳性神经元的变化,探讨高 碘对中枢神经系统的影响. 方法:实验于2004—0l/20O4一l0在河北医科大学完成.选择昆明种初断 乳健康小鼠l6只,随机分为适碘组与高碘组.每组8只.分别以含碘量 为50L,3000L蒸馏水喂养小鼠6个月,于实验第l80天断颈 处死动物,摘取甲状腺,制作病理切片,苏木精一伊红染色.光镜下观察 甲状腺的形态变化证实高碘甲状腺肿模型复制成功.采用还原型尼克 酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶组织化学方法观察高碘对小鼠下丘脑室旁 核一氧化氮合酶阳性神经元的影响. 结果:在实验过程中各组动物无异常死亡,均进入结果.(光镜下 可见适碘组甲状腺滤泡大小形态不一,滤泡腔内有中等量的粉红色胶 质,滤泡为单层立方状或高柱状,核圆形或椭圆形位于细胞中央,细胞 质中等,毛细血管丰富;还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶阳性神 经元呈高尔基样分布于室旁核外围,细胞形态为多角形,梭形,椭圆形, 胞浆饱满且呈兰色深染,突起明显,有较多深染的纤维.?光镜下高碘 组甲状腺滤泡明显扩张,腔内充满大量染色的红色胶质滤泡上皮细胞, 扁平,核呈梭形,滤泡间质减少;室旁核仅见零星散在的还原型尼克酰 胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶阳性神经元,细胞形态以梭形,椭圆形为主, 胞浆淡染,胞核不染色,突起不明显,几乎见不到阳性纤维.?高碘组室 旁核一氧化氮合酶阳性细胞密度较适碘组明显降低,差异有显着性 [(24~2.7),(81.5+3.5)个/0.0lmm,t=2.306-3.355,P<0.01). 结论:高碘可以引起小鼠室旁核细胞一氧化氮合酶染色阳性神经元密 度明显降低且染色变浅,突起变短.高碘可能通过引起小鼠下丘脑室旁 核细胞一氧化氮合酶阳性细胞的变化而影响一氧化氮合成.从而可能 对中枢神经系统功能造成影响. 主题词:一氧化氮合酶;高碘;室旁核;NADPH脱氢酶 O引言 一 氧化氮近年来已被证实是存在于中枢及周围神 经系统的重要信使物质,在中枢神经系统有广泛的分 布,一氧化氮以L一精氨酸为底物在一氧化氮合酶催化 下合成,因其极易扩散且半衰期短,所以一氧化氮的作 用与一氧化氮合酶密不可分,研究表明,分布于神经系 统的还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶实验上就 是一种一氧化氮合酶.一氧化氮已被证实可影响下丘 脑一垂体一神经内分泌轴"-3】,提示一氧化氮及一氧化氮 合酶可能参与下丘脑一垂体神经内分泌免疫网络多种 功能调节.一氧化氮合酶阳性神经元在下丘脑主要分 布于室旁核及视上核.为此,作者进行了高碘对小鼠室 旁核一氧化氮合酶阳性神经元的影响的初步探讨. 98 ISSN1671—-5926CN21—-147O/R m础cornkf'23385083@sina.com杨长春,等.高碘喂养小鼠室旁核一氧化氮合酶阳 性神经元的变化 1材料和方法 :随机对照动物实验. 单位:武装警察部队总医院及河北医科大学. 材料:实验于2004—01/10在河北医科大学完成. 实验动物为昆明种初断乳健康小鼠l6只,雌雄各半, 体质量11~14g,河北省实验动物中心提供(许可证号: 冀040056).随机分为适碘组与高碘组,每组8只. 设计,实施,评估者:设计由第一,二,三,四作者 完成,干预为第一,二,三,四作者,评估为第五,六作 者,均经过系统科研,盲法评估. 方法: 高碘甲状腺肿模型的建立:适碘组与高碘组动物 均喂养普通鼠料,昼夜光照调节.适碘组饮用含碘量 为5Og/L的适碘水,高碘组饮用蒸馏水加碘酸钾制 成的含碘量为3000g/L的高碘水,喂养6个月, 于实验第180天断颈处死动物,摘取甲状腺,固定于 体积分数为0.1的中性甲醛中,脱水,石蜡包埋,苏木 精一伊红染色.光镜下观察甲状腺的形态变化证实高 碘甲状腺肿模型复制成功. 还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶组化反 应{41:40g/L多聚甲醛灌注固定,取脑,置4?相同固定 液中固定过夜,依次移入150g/L,300蔗糖磷酸缓 冲液中(0.1mol/L磷酸盐缓冲液,pH7.4)于冰箱内放 置沉底,连续冰冻冠状切片,片厚20m,0.1mol/L磷 酸盐缓冲液pH7.4接片,每两三张取1片,每只取三四 张进行还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶组化反 应:将切片移入10Triton.100pH7.4预浸60min. 切片移入孵育液,37?温箱中孵育3h,孵育液『(O5mg还 原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶,sigma,typeI), O.5mg硝基四氮唑蓝,Olmol/LBP(pH7.4)冲洗3 次,5min/次,终止反应.明胶载片裱片风干,中性红复 染,常规脱水,透明封固.此法显示神经元为蓝黑色, 类似Golgi镀银染色外观,胞体,神经纤维及纤维终末 均可染色. 评估:以目镜网格测试系统计数室旁核一氧 化氮合酶阳性神经元.计数海马单位面积内的阳性神 经元,神经元密度以O.O1mm内的阳性神经元数表示 (10xl0方格测试系统,显微镜下计数),每只计数5张 切片,每张切片定点计数两个视野,取平均值. 主要观察指标:甲状腺病理形态学改变,室旁核 一 氧化氮合酶阳性神经元变化. 统计学分析:第一作者应用SPSS11.0统计软件, kS,行t检验. 实验数据均表示为X-- 2结果 2.1实验动物数量分析在实验过程中各组动物无 异常死亡,均进入结果分析. 2.2甲状腺组织形态学观察光镜下可见适碘组甲 状腺滤泡大小形态不一,滤泡腔内有中等量的粉红色 胶质,滤泡为单层立方状或高柱状,核圆形或椭圆形位 于细胞中央,细胞质中等,毛细血管丰富,见图1.光镜 下高碘组甲状腺滤泡明显扩张,腔内充满大量染色的 红色胶质滤泡上皮细胞扁平,核呈梭形,滤泡间质减 少,见图2,结果证实高碘甲状腺肿模型已复制成功. 2.3还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶组化染 色结果适碘组还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢 酶阳性神经元呈高尔基样分布于室旁核外围,细胞形 态为多角形,梭形,椭圆形,胞浆饱满且呈蓝色深染,突 起明显,有较多深染的纤维,见图3.而高碘组室旁核仅 见零星散在的还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶 阳性神经元,细胞形态以梭形,椭圆形为主,胞浆淡染, 胞核不染色,突起不明显,见不到阳性纤维,见图4. 2.4室旁核一氧化氮合酶阳性细胞密度的定量分析 高碘组室旁核一氧化氮合酶阳性细胞密度较适碘组 明显降低,经检验差异有显着性『(24?2.7)×10, (81.5+3.5)×10个/mm2t=2.306-3.355,P<0.01l. 3讨论 下丘脑室旁核是哺乳动物中枢神经系统的重要枢 纽,它通过其神经分泌系统应答多种刺激引起的机体 变化,维持机体内外环境的平衡.目前研究表明,一氧 化氮对下丘脑多数递质或激素的释放具有中介作用, 参与了下丘脑内的多种功能调节其中包括对神经内 分泌和心血管等功能的调节作用.室旁核许多神经元 内含有合成一氧化氮的一氧化氮合酶,一氧化氮通过 扩散作用于周围神经元或自身,通过升高cGMP水平 . 触发生一系列生物效应Il一 研究表明,一氧化氮参与下丘脑一垂体神经肽的 内分泌调节,与催产素,加压素水平有关I6...,室旁核,视 上核是神经垂体激素的来源,均可产生催产素和加压 素.催产素和加压素除对生殖,对血压和渗透压的调节 作用外,还与学习记忆有关.在以厌恶性条件反应为行 为模式的实验研究显示,当大鼠脑组织加压素降低时 其学习和记忆过程易被搅乱,而以加压素和相关活性 片段的处理则可恢复正常,提示其可以提高学习和记 忆功能.加压素对记忆的影响一般认为与其对边缘系 统神经元的兴奋有关,在大脑边缘系统中有神经递质 效应,还可调控长时程增强效应因而与学习记忆有关. 一 般认为催产素是一种健忘神经肽,但Popik以微量 的催产素注射于视前区则使认知功能提高,另外, Tomizaua等嘲发现还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱 氢酶和下丘脑分泌的催产素和加压素有共存关系,认 为一氧化氮对上述物质合成和释放具有一定的影响. 生理学研究提示,下丘脑室旁核是心血管功能调 ISSN1671-5926CN21—1470/R--.zgcc~f.com中国l临床康复2006年1月15日箜! 堂蔓— 节的重要核团.下丘脑室旁核内一氧化氮合酶含量的 改变可能与高血压的形成发展有关[91,对大鼠下丘脑 室旁核内单侧微量注射一氧化氮合酶抑制剂可以引 起平均动脉压升高,心率加快,而注射L-ARG可使血 压下降,心率减慢,提示一氧化氮在下丘脑室旁核心 血管活动调节过程中有明显的紧张性抑制作用【l01.室 旁枢及视上核神经元释放催产素,加压素到垂体后 叶,通过体液方式对心,肾及生殖功能进行调节,通过 发出纤维投射到第三脑室,将催产素,加压素释放到 脑脊液,以非突触方式对中枢系统部位产生影响,参 与多种神经调节.另外,催产素,加压素神经元也可能 通过脑干和脊髓下行纤维对内脏活动进行交感或副 交感性控制. 高碘对中枢神经系统的影响目前尚无定论,已有 动物实验研究表明,高碘不仅可以引起甲状腺肿,而 且还可导致豚鼠大脑皮质,海马组织一氧化氮合酶活 性和一氧化氮含量降低以及小鼠脑组织一氧化氮含 量的降低.大脑皮质及海马组织功能与学习记忆有关, 而一氧化氮作为一种非经典的新型的神经递质和信 息分子在神经系统中具有重要作用,其中包括通过长 时程增强作用,参与突触的可塑性变化,参与学习,记 忆过程,因此高碘可能通过抑制大脑皮质及海马组织 一 氧化氮合酶活性降低一氧化氮含量进而影响学 习,记忆与智力,脑组织中一氧化氮含量的下降可能 是导致高碘引发脑功能障碍的原因之一;牛磺酸和 DHA,EPA能通过提高脑组织中一氧化氮的含量来拮 抗高碘所致的脑损伤f11,121. 本实验结果显示,应用高碘水喂养小鼠180d后, 高碘组小鼠甲状腺明显肿大,甲状腺组织病理形态学 结果显示,高碘组甲状腺滤泡明显扩张,腔内充满大 量染色的红色胶质,滤泡上皮细胞扁平,核呈梭形,滤 泡间质减少,呈现高碘甲状腺肿特有形态学改变,这 表明高碘甲状腺肿动物模型复制成功.在此基础上, 应用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶组织化 学反应方法,观察高碘对下丘脑室旁核一氧化氮合酶 阳性神经元变化的影响. 还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氨酶组化染 色结果显示,与适碘组比较,高碘组小鼠下丘脑室旁 核一氧化氮合酶阳性细胞密度明显降低,胞浆淡染, 胞核不染色,突起不明显,几乎看不到阳性纤维,证实 高碘可以引起下丘脑室旁核一氧化氮合酶阳性细胞 数量减少,为过量碘对中枢神经系统的影响提供了新 的形态学依据.由于室旁核是下丘脑中重要神经核团 之一,既有神经内分泌的功能,又有典型的神经调节作 用,而且室旁核内有大量一氧化氮合酶阳性神经原, 在实现交感一肾上腺髓质和下丘脑一垂体一肾上腺皮质 99 两大系统的整合中起着重要作用,调节机体多种生理 功能,因而作者推测高碘可以通过下丘脑室旁核一氧 化氮合酶酶阳性神经元的减少由此引起一氧化氮水平 的降低,从而可能导致对下丘脑一垂体神经肽的分泌 及其他多种功能产生影响,其中包括不仅对学习记忆 产生影响,还可能对心血管,肾脏,生殖等其它生理功 能产生影响.而一氧化氮合酶阳性神经元数量减少的 可能与神经元一氧化氮合酶持续合成不足或一氧化氮 合酶神经元丢失有关. 本实验结果进一步证实,高碘对中枢神经系统的 损伤可能与其抑制一氧化氮合酶活性和降低一氧化 氮合成有关;高碘可能通过引起下丘脑室旁核一氧化 氮合酶阳性神经元的减少而影响一氧化氮的合成,进 而导致对中枢神经系统的损伤及功能障碍;此外,作 者还推测,高碘对学习,记忆与智力的影响不仅与对 海马和脑皮质一氧化氮的合成减少有关,还可能与室 旁核一氧化氮合酶阳性神经元的减少及一氧化氮的 合成减少有关.本实验不仅为过量碘对中枢神经系统 的影响提供新的实验依据,同时,也为高碘对心血管 系统,生殖系统等其他系统的影响提供初步实验依 据,对于进一步研究高碘对机体损伤及防护对策具有 重要的意义.但高碘对下丘脑室旁核一氧化氮合酶阳 性神经元影响的详细机制目前尚未明了,还有待于进 一 步研究. 本结果表明,长期过量高碘可能对人体健康造成 深层次不良影响,因而再次提醒人们,提倡科学补碘, 勿长期过量补碘及滥用碘剂. (图1-4见插图2—1页) 4参考文献 1万选才,杨天祝,徐承焘.现代神经生物学【M】.北京:北京医科大学协和医科 大学联合出版社.1999:423 2RivierC.Roleofnitricoxideinregulatingtherathypothalamic-pituitary-a- drenalaxisresponsetoendotoxemia.AnnNYAcadSci2003;992:72-85 3杨志军.徐如祥.饶志仁.等."免疫-脑通讯"通路中延髓内脏带至下丘脑室 旁核儿茶酚胺能作用的实-~[J1.中国临床康复,2005,9(5):212--4 4张松筠,杨天祝.马常开,等.2型糖尿病模型db/db小鼠海马NOS阳性神 经元变化【J1.解剖科学进展,2002,80):22-4 5VacherCM,Hardin—PouzetH,SteinbuschHW,eta1.Theeffectsofnitricoxide onmagnocellularneuronscouldinvolvemultipleindirectcyclicGMP-depen- dentpathways.EurJNeurosci2003:17(3):455—66 6AmirS,RackoverM,FunkD.Blockersofnitricoxidesynthaseinhibitstress activationofc-Fosexpressioninneuronsonthehypothalamicparaventricular nuoleusintherat.Neuroscience1997;77(3):623—7 7jiYP.MeiJEffectofintracerebralventricularinjectionofnitricoxidedonor andnitricoxidesynthaseinhibitoronthespontaneousdischargeofmagnocel- lularneuronsofparaventricularnucleusintherat.ActaPhysiologicSinica 2000;52(1):29-33 8Tomizawak,lgaN.IJuYF,eta1.Oxytocinimproveslong-spatialmemorydur- ingmotherhoodthroughMAPKkinasecascade.NatNeurosci2003;6(4):384- 90 9XuY.KrukoffTLDecreaseinarterialpressureinducedbyadrenomedallinin thehypothalamicparaventrlcularnucleusismediatedbynitricoxideandGA- BA.RegPept2004;1l9(1-2):21—30 lO娄雪林,金必连,余承高,等.内源性一氧化氮在下丘脑室旁核的心血管作 用【J1.同济医科大学,1999,28(6):500—2 11杨长春.尹桂山,朱惠民.等.过量碘对中枢神经系统影响的实验研究'?中 国地方病防治杂志,2000.15(2):65—7 l2许丽辉,尹桂山,朱惠民,等.牛黄酸和DHA,EPA对高碘仔鼠脑组织NO 含量的影响IJ1.中国地方病防治杂志,2000,15(4):206-7 抑郁症患者面孔加工事件相*电位时空模式特征 l?l川l?llfl?I-I……|lIF"I…I'JII?T{Inll|lr…'"'''…"iII.…?' ::毫霪若:— k.—J.?.0'?j ,?,一:::箸:;:: 悄—,,.嘎._!_雹,,,一嘲u???() 目!'H.rt1-【L^"4 目{""々"" 一 氧化碳中毒大鼠脑红蛋白表达变化及对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响… ?J.I'1Inh?l'】?l?'??…【…—Inr?nlh'II?H……'……"…j?1|.I…】tv[1_.?v『…厂l …|1?II[[L'f,…{,,Ir~1] cLt7?l 辘':鎏l鼬峨.'l.毒 高碘喂养小鼠室旁棱一氧化氯合酶阳性神经元的变化' ?fdplhigh…lil,I?II1,pil…?,?I,l1_??…ii…1IIIl?r…l?Jc?川Isf1f… (*7? ,l-~_一l_ . 一 '… , . … ? .:? '鬻;ooo 日II_】n'n【?L^""&硝1?I 目?tI『m{IhHJ1 目】r{m{}h—m?lIT?【,cEt=_IRl?} 目4『一},i?I}t1{Et々=*i?xI?) 慢性应融大鼠结肠黏膜形态学变化及氟基胍的保护作用 M"h?c??I【I??crnL?{…nIl-?嘴川……s『J#Tlhprm…II【urHn】J【lHI1|m? ctn$I?) ooI-o 目『**目M?tmEl_x2n0)H:mn.*自&IEm"#^自}" Rgt"^?}口 目2Ln?cHJ7(I)?#..《?#.I,:?n.袒.域 一 k?f#{?ll-m4t胞kt帘li}.啦n一,.接 , { 《 m } 自 自} ?h她m x? " ? mn t 赴 , #自 自 ‰^ } tn t _自 自 h ? 阜? " 3 一 1 目* 也 ^