补阳还五汤对内毒素血症大鼠脾细胞凋亡的实验研究

补阳还五汤对内毒素血症大鼠脾细胞凋亡的实验研究 补阳还五汤对内毒素血症大鼠脾细胞凋亡的实验研究 张畔 天津市第一中心医院 摘要目的:通过静脉注射脂多糖(,,,)复制大鼠急性内毒素,,，,症模型，探讨补阳还五汤在改善,,,所致的脾损伤(细胞凋,中的作用及其分子机制，为内毒素血症免疫功能的深入研究及其中西医结合治疗提供依据和线索。方法, ,,染色光学显微镜观察脾脏形态学变化，,,,,,法测定牌细胞凋亡，免疫组化测定脾,;,,,，,,,表达。结果:模型组(,,,,,防治组随,,,作用时间的延长，光镜下脾白髓逐渐萎缩，淋巴小结破坏逐渐加重;,,,,,染色发现凋亡细胞首先出现于脾小体，随后动脉周围淋巴鞘亦(口,(见;在模型组(,,,,,防治组，凋亡细胞及,,,染色阳性细胞，,,值均逐渐增加，至,,,或,,,达高峰，以后渐降，而,;,,,染色阳性细胞，,,值则逐渐下降，至,,,，时达,亩峰，以后渐升。,,,,,防治组比模型组细胞凋亡及,,,阳性细胞染色显著改善，而,;,一,阳性细胞染色无明姓改善。结论:,,,所致脾损伤在,,,症状最重，脾细胞凋亡及,;,一,，,,,变化最明显，与大鼠病情严重程度密切相关;补阳还五汤能减轻严重脓毒症症状，这可能与其减弱,,,对脾细胞凋亡的促进作用，改善脓毒症大鼠免疫功能状态有关。【关键词〕内毒索血症 补阳还五汤 脾 细胞凋亡 ,;,,, ,,, 内毒素血症(,,,,,,,,,,,，,,,)是由于血中细菌或病灶释放出大量内毒索至,液，或输入大量内毒素污染的液体而引起，它对脓毒症、多器官功能障碍综合征 (,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,;,,,, ,,,,,,,,，,,,,)的发生、发展具有健进作用，亦是造成肠源性继发感染、全身播散性感染的重要前期阶段。内毒素赢症患者主要的死因为内毒素性休克和多器官衰竭(,,,)，而休克和,,,贝,可能与内毒素血症后期过度的炎症损害或继发性感染有关。因此，人们推测抗炎反应及免疫麻痹是内毒素血症主要的损伤因素?。。脾作为人体最大的外周免疫器官，是免疫细胞居住和对血源性抗原产生应答的主要?,荽骋窖Ю砺酃鄣惴治觯诙舅厝胙碌模樱桑遥邮抵剩贩从车氖腔逭敖徽淖刺悖粒遥釉蚍从车氖钦蘖剐白刺硐治懊庖呶薹从π浴被蚨愿腥疽赘行裕逑制跹糁栊椋蘖剐暗摹靶笆滴慈ィ研椤弊刺饩吞崾疚颐侨裟芎侠矸稣剐埃锏交逭逅降摹耙跗窖糈住蔽抟捎兄诘鹘诖傺缀涂寡追从Φ钠胶狻?鞫岣呙庖吡Α,蹩翁饽夤鄄煲嫫钛矸郊补阳还五汤对急性内毒素血症大鼠症状，脾细胞凋亡及其分予机制的影响，为急件内毒素血症的巾尴医结合防治提供可靠依据。材料和方法 ,材料 ,(,实验动物:健康雄性清洁级,,,,,,火鼠(合格证号,;,,,津,,,,—,,,,)，体重 ,,,?,,,，购白天津市放射医学研究所实验动物中心。分笼饲养,只,笼，自由进 食饮水，实验前在实验环境中适应,周。清洁饲养窒保持恒温(,,?)，相对湿度 为,,,’,,,。 ,(,药物 大肠杆菌脂多糖(,,,,,,,,,,;;,,,,,,,，,,,，,,,:,,)，购自美国,,,,,公 司，,,,,,,支，实验时用生理盐水配置成,,,,,,。 补阳还五汤浓缩液，依原方组成，各组分(黄芪,,,,，当归,,，赤芍,,，川芎 ,,，桃仁,,，红花,,，地龙,,)的中成药颗粒购自江阴天江药业有限公司，换算成 相应生药剂量，使用前用开水冲服(相当于含生药, ,,,,)。,(,实验试剂 ‘ 光镜标本制作试剂由天津市第一中心医院危重病晕点实验室提供;原位细胞凋产检测试剂(德国,,;, ,公司):,;,,,和,,,蛋白免疫组化试剂盒(,;,一,,,,,,,,,一,,,:,,,,,,,,:,;,,,,，美国,,,,, ,,,,公司);过氧化物酶标记的链霉卵白索染色试剂盒(美国,,,,,公司);,,,显色试剂(美国,,,,,公,(,,)。其它实验仪器包括切片机、微波炉、染色缸、湿盒、烤箱、电热恒温培养箱、,,一,,,,, ,,倒置显微镜。 , ,,,造模和取材,,,,,,大鼠随机数字分成, ,组: (,)正常对照组(,只):用生理盐水灌胃,,后尾静脉缓慢注射生理盐水，再用生理盐水灌胃,,,; (,)模型组(,,只):用生理盐水灌胃,,肝尾静脉缓慢注射,,,(,,,,,,)〔,, ,再用生理盐水灌胃，分别于,,,注射后,,，,,,，,,,，,,,，,,,后处,夕匕取脾; (,),,,,,防治组(,,只):用补阳还五汤(,(,,,(,,,,?,))瞄，灌胃,,后尾静脉缓慢注射,,,(,,,,,,)，再用补阳还五汤(,(,,,(,,,,?,))灌胃，分别于,,,注射后,,，,,,，,,,，,,,，,,,后处死取脾。,(石蜡切片,,染色大鼠脱臼处死后，迅速剪开腹腔，小心剥离脾脏，用滤纸吸去附带血液，将标本置于,,多聚甲醛中同定,,后，常规梯度浓度洒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋。连续切片，厚度, , ,，用涂有多聚赖氨酸的载玻片贴片，,,?烘烤,,,，苏木精一伊红染色，光镜观察。,(原位末端标记法染色(,,,,,染色)各组石蜡切片经二甲苯脱螨和梯度酒精水化，应用原位凋亡检测试剂盒进行染色，光镜观察。,(免疫组化,,,法检测脾脏,;,,,、,,,蛋白表达各组石蜡切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精水化，应用,,,法进行染色，光镜观察。,(图像分析和统计学处理应用,,,,, ,,, ,,,, ,(,图像分析系统进行图像采集及分析。光镜下低倍视野(×,,,)先观察反应情况，每组分析,个标本，每个切片随机选取,个高倍视野(, ,,)进行分析。，,,是指光密度值和所测面积内的阳性面积的积。一般认为,,,能较准确的反映阳性产物表达的状况。凋亡细胞核内,,,特异,’末端被特殊标记，呈棕褐色染色，为,,,,，。染色阳性细胞。而,;,,,。或,,,染色细胞胞浆棕黄色为阳性表达。计量资料数据采用均数?标准差(孑?,)表示，均数问比较采用单因素方差分析(,,,,,,, ,,,,,)。相关系数采用,检验。 结果,实验鼠症状与体征,(,正常对照组动物外观、活动及各项体征均表现正常。,(, ,,,注射后,,大鼠首先出现精神萎靡，竖毛，扎堆，耳部血管轻度充血，随后出现腹泻、腹胀、呼吸喘促、肢端厥冷、唇爪发绀等表现;,’,,,上述症状逐渐加重。,,,’,,,大鼠上述症状逐渐缓解;,,,,,防治组比同时间点模型组动物症状相对较轻，出现时间较晚。,各组内毒素血症大鼠脾脏组织结构的变化,(,正常埘照组:火鼠脾组织结构清晰，小梁清楚(白髓内含大量的淋巴小结(附图,—,，, ,,)。,(, ,,,注射后,,模型组大鼠脾脏红，白髓分界尚清，部分淋巴小结轻度破坏(附图卜,。,,,)。,,,,,防治组大鼠脾脏与正常对照组比较无明显差别(附图,,,，,,,)。,,’,,,模型组大鼠脾脏红(白髓分界不清，白髓萎缩明显，多数淋巴小结破坏(附图,,,，×,,)。,,,,,防治组鼠脾脏损伤较模型组轻，红，白髓分界欠清，白髓萎缩，尚可见部分淋巴小结(附图,—,，×,,)。,,’,,,组模型组大鼠脾脏白髓面积逐渐增大，淋巴小结破坏有所缓解(附图,—,，,,,)。,,,,,防治组大鼠脾脏多数淋巴小结逐渐恢复至正常(附图, ,,，,,,)。,补阳还五汤对各组内毒素血症大鼠脾细胞凋亡的影响(见表,),(,模型组内各时间点比较 与正常对照组(附图,,,，×,,,)比较，，。,, ,,(附图,,,，×,,,)，,,,，,,,，,,,组阳性染色显著增多，至,,,，时达高峰(附图,,,，×,,,)，阳性细胞首先出现于脾小体，随后出现于动脉周围淋巴鞘，而,,,，,,,组阳性染色逐渐减少(附图,,,，, ,,,)。,(, ,,,,】,,,防治组内各时间点比较 与正常对照组(附图,—,，×,,,)比较，,,, ,,(附图,,,，×,,,)、,,,、,,,组阳性染色显著增多，至,,,，时达高峰(附图,,,，×,,,)，阳性细胞主要分布于脾小体而,,,，,,,组阳性染色逐渐减少(附图,,,，, ,,,)，至,,,阳性染色渐恢复至正常。,(,各时间点模型组、,,,,,防治组比较 在,,, ,,、,,,(,,,，,,,,,防治组阳性细胞染色均较模型组显著减少，差异有统计学意义(见图,)。 表,各组动物脾组织,,,,,检测阳性细胞，,,值比较(元?,) ,, ?与正常对照组比较，,,,(,,;?与同组,,组比较，,,,(,,;,与同组,,,组比较，,,,(,,;?与同组,,,组比较，,,,(,,;?与同组,,,组比较，,,,(,,;?各时相防治组与模型组比较，,,,(,,。,补阳还五汤对内毒素血症大鼠,;,,,、,,,蛋白表达的影响(见表,),(,模型组内各时间点比较 (与正常对照组(附图,，,,,,)比较，,,, ,,，,,,、,,,，,,,组,,,阳性染色显著增多(附图,,,，×,,,)，,,,后表达逐渐减弱，至,,,表达明显减少但仍低于正常。 与正常对照组(附图,，×,,,)比较，,,, ,,，,,,、,,,组,;,一,阳性染色急剧下降(附图,,,,，×,,,)，,,,后表达逐渐增加，至,,,表达仍低于正常。,(,,,,,,防治组内各时间点比较 与正常对照组比较，,,, ,,、,,,、,,,、,,,组,,,阳性染色显著增多(附图,,,，, ,,,)，,,,后表达逐渐减弱，至,,,表达明显减少至接近正常。 与正常对照组比较，,,, ,,、,,,，,,,组,;,,,阳性染色下降(附图,,,,，×,,,)，,,,后表达逐渐增加，至,,,，,,,表达接近正常。,(,各时间点模型组，,,,,,防治组比较 在,,, ,,、,,,，,,,，,,,,,防治组,,,阳性细胞染色较模型组增加，而,,, ,,, ,,,，,,,,，)防治组,,,阳性细胞染色较模型组显著减少，均有统计学差异(见图,)。 在,,, ,,、,,,，,,,、,,,、,,,，,,,,,防治组,;,,,阳性细胞染色与模型组比较，差异无统计学意义(见图,)。,对细胞凋亡作相关性分析:,(, ,,,与细胞凋亡呈正相关，相关系数,,,(,,,，,,,(,,,，在,,,(,,水平下线性关系显著。 ,;,,,与细胞凋亡呈负相关，相关系数,,,,(,,,，,,,(,,,，在,,,,(,,水平,(,下线性关系显著。 组别 ———楼理组 一,, ———泊疗组 ，,，?,;至 ,疗维 量 ,, ，,, ,,, ,,, ,,, 对闻点 (图,) 组别 ———蕞塑组 ———诅疗组 —,父一;墨 ,,, ,,, ,,, ( ,,, 对栩点 (图,) 表,各组动物牌细胞,,)【(,;,(,免疫组织化学检测阳性细胞，,,位比较(,?,)?与正常对照组比较，,,,(,,;?与同组,,组比较，,,,(,,:,与，可组,,,组比较，,,,(,,:?与同组,,,组比较，,,,(,,;?与同组,,,组比较，,,,(, ,:,,各时相防治组与模型组比较，,,,(,,。讨论 ,,等?,也发现一些内毒素血症患者可出现免疫低下、免疫抑制或免疫 ,,,,,;,,麻痹，由此引起迅速的难以控制的继发性感染，是引起内毒素血症患者死亡的主要原因之一。脾脏作为机体最,人的外周免疫器官，其中,淋巴细胞占,,,,,,,，,淋巴细胞占,,,’,,,，其存机体受到外来抗原侵袭时产生的细胞和体液免疫应答中起重要作用。本实验研究发现:,,,静脉注射后，在外周淋巴器官中首先是脾小体(即,细胞聚集区)发生病理改变，然后才是动脉周围淋巴鞘(即,细胞密集区)改变。,,,,,染色结果证实，,,,所致牌细胞的损伤主要为细胞凋亡。我们认为:,,,静脉注射后脾脏,淋巴细胞的病理变化均较,淋巴细胞出现早，提示,,,可能是通过先激活,淋巴细胞和,或巨噬细胞，刺激炎性介质释放而造成,淋巴细胞损伤，,、,淋巴细胞的大量凋亡减弱了内毒素血症患者抵抗病原的刍,,胞和体液免疫。图像分析结果表明，随,,,注射后时间延长、细胞凋亡现象增加，至,,,达高峰:但在内毒素血症后期细胞凋芒则逐渐减少。这可能一方面与体内内毒素刺激物的清除，使淋巴细胞凋亡减少有关，另一方面也,,,‘能与单核一巨噬细胞对凋亡细胞的清除相关。这种凋亡细胞的有效清除在组织修复和炎症的消除过程巾是非常重要的，这也可能是导致内毒素血症大鼠幸存的主要原因。我们选用,;,,,家族成员,,,最具代表意义的抗凋亡成员,;,,,和促凋亡成员,,,，探讨影响免疫细胞凋亡的凋亡相关基因的变化，为我们钊‘对细胞凋亡途径改善内毒素血症脾细胞凋亡，以达到提高患者免疫机能。我们发现:与正常对照组比较，,,, ,,、,,,、,,,，,,,组,,,阳性染色显著增多，,,,后表达逐渐减弱，至,,,表达明娃减少但仍高于正常。另…方面，与正常对照组比较，,,, ,,，,,, ,,,组,;,,,阳性染色急剧，卜降，,,,后表达逐渐增加，至,,,表达仍低于正常。已有的理论证实:短期激活的淋巴细胞可因,;,,,的高表达而抵抗(乡,亡受体介导的细胞凋亡，从而发挥免疫应答，而本实验模型组人鼠在发病的前,,,内,;,一,表达急剧下降，,,,表达上升，这在一定程度上促进了细胞凋亡的发牛。 补阳还五汤是体现清代名医王清任所创气虚血瘀理论的代表方剂，其特点为以补气扶正为主，同时辅以活血祛邪治疗。本实验研究结果显示:补阳还五汤的防治使内毒素血症大鼠不同时问病情严霞程度均较模裂组减轻。虽然脾细胞凋,’,,,,,,染色阳性细胞及,,,、,;,,,蚩白阳性细胞染色变化趋势与内毒素血症大鼠基本一致，但模型组与,,,,,防治组各时间点组问比较显示:在,,, ,,，,,,，,,,,,,,,防治组,,,,,及,,,,,,性细胞染色较模型组减少，有显著性统计学差异;而,;,一,阳性细胞染色较模型组亦减少，但其著异无统计学意义。我们发现,,,注射后的,,,内，为内毒素血症症状及脾细胞凋亡最严重时期，而此时补阳还五汤的防治使其临床及脾细胞凋亡改善最明显，由此我们推测:补阳还五汤,能对,,,重度脾损伤效果显著。我们运用具有大力扶正固本作用的补阳还五汤进行早期预防，其作用,,,‘能是通过增强脾细胞臼身的保护作用，以致当机体受到内毒素打击后，脾损伤延缓或减轻。补阳还五汤对,(,,所致的脾损伤的保护作用机制可能是通过补阳还五汤减弱了,,,与其基因自身或与,;,,,家族其他成员形成同型(,,,,,,,)二聚体后产生的促凋亡作用相关，也可能是补阳还五汤与,;,,,结合后，竞争性抑制了,;,,,与,,,结合，从而使,,, 所致的脾细胞凋亡减少，以达到改善内毒素血症大鼠免疫抑制的目的。补阳还五汤(足通过何种途径影响,,,表达这有待于我们的进一步研究。另外(补阳还五汤是一剂方药，是其中某种成分单独起作用，还是某些成分协同起作用，亦有待我们进一步研究。参考文献〔,〕,,,,, ,(,,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,,,(，,,,,,,,, ,,,, ,,,，,,,,，,,(,):,,,,’,,,,〔,〕,,,,,, ,，,,,,,,,,, ,，,, ,,(,,,,,,—,,,;,,,; ,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, —,(,,一,) ,,, ,,,—,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,(,,,,—,),, , ,,, ,,,,, ,, ,,,,,; ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,;,,,, ,,,,,,,,(,,,;,,, ,,,,,,;,,，,,,,，,,(,):,,,、,,,〔,〕徐淑云(药理实验方法学(第三版)(人民卫生…版社，,,,,:,,,’,,,〔,〕,,,,,;,, ,,，,,,,,,, ,，,,,,,,,,, ,，,, ,,(,,,,;,,,, ,,,,;,, ,, ,,,,,,,;,,, ,,,;,,,, ,, ,,,’,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,;,,,,(,,, ,,,,。,,,,，,,,:,,,、,,,,,,防治组)(附,,,,,，, ,,。)(,,,模型组) (附图,—,，×,,,)(,,,防治组) 附图(脾脏,眠、,,,一,免疫组化染色)(附图,,—,。, ,,,)(,;,一, ,,,模型组)(酣图,,—,，×,,,)(,;,一, ,,,防治组)