儿茶酚胺类物质的分离分析方法研究进展

儿茶酚胺类物质的分离分析方法研究进展 龙 梅 (赤峰学院 化学系，内蒙古 赤峰 024000) 摘 要:儿茶酚胺(CAs)类物质主要包括肾上腺素(E)，去甲肾上腺素(NE)，异丙肾上腺素和多巴胺(DA).人们对此类物质的分析研究始于20世纪40年代，早期的测定方法主要是三羟基吲哚法和乙二胺缩合法.随着分析科学的蓬勃发展以及对儿茶酚胺研究的深入，国内外很多研究者开始将前期分离与后期检测步骤结合，开发出了一系列高效、高选择性、高灵敏度的儿茶酚胺类物质测定新方法.本文总结了最近十年来国内外对生物样品中儿茶酚胺类物质的新型分离分析方法的发展概况. 关键词:儿茶酚胺;分离分析方法;肾上腺素;去甲肾上腺素;多巴胺 中图分类号:Q599 文献标识码:A 文章编号:1673-260X(2011)03-0001-03 儿茶酚胺类物质主要包括肾上腺素(E)，去甲肾上腺素(NE)，异丙肾上腺素和多巴胺(DA)[1].这一类物质的化学结构特点是:都有一个双羟基苯核和一个带氨基的侧链.儿茶酚胺类物质作为交感肾上腺素能神经元和肾上腺髓质合成与释放的单胺类神经递质，是生物体内具有较强生理学效应的内源性活性物质，在脑和神经信号传导中起着重要的作用并且与多种生理、病理现象密切相关[2].它们不仅直接参与行为活动以及血压、心率呼吸和睡眠等植物神经功能调控，而且还与一些功能性疾病如神经分裂症、忧郁症以及器官性病变的出现有关.例如，肾上腺素既对心血管起作用，又是促进分解代谢的激素.同时这类物质还可以作为药物，具有抗氧化、抗诱变和抗衰老等作用.如多巴作为治疗帕金森病的特效药，能穿越血脑屏障脱羧后产生神经递质DA;NE为拟交感神经药，具有收缩血管、升高血压作用[3].因此，提供体液或组织中儿茶酚胺类物质代谢浓度变化的信息在神经生理研究与递质代谢异常相关疾病诊断治疗及预后有着重要的意义. 儿茶酚胺的分析研究始于20世纪40年代，早期的测定方法主要是三羟基吲哚法和乙二胺缩合法[3].随着分析科学的蓬勃发展以及人们对儿茶酚胺研究的深入，产生了多种测定方法，如荧光光谱法、化学发光法、电化学法、免疫分析法、质谱法和各种色谱法等[4].但是实际生物样品中儿茶酚胺含量极微(ng/L)，生物活性极不稳定，加上生物样品中本身存在的许多结构相似的代谢物及较多内源性化学干扰物，造成了测定的困难[5].因而高选择性、高灵敏度地测定某一种儿茶酚胺类物质是当前的一个研究难点.基于这样的现实，国内外很多研究者开始将前期分离与后期检测步骤结合，开发出了一系列高效、高选择性、高灵敏度的儿茶酚胺类物质测定新方法.本文总结了最近十年来国内外对生物样品中儿茶酚胺类的新型分离分析方法的发展概况，其中分离步骤包括高效液相色谱法(HPLC)与毛细管电泳法(CE)，检测方法包括电化学法(ECD)、质谱法(MS)、化学发光法(CL)和荧光法(FL)等. 1 分离方法 1.1 高效液相色谱法 高效液相色谱法在儿茶酚胺类物质的分析中应用相当广泛，这与它的高分离效率密不可分.儿茶酚胺类物质虽然具有较强的结构相似性，都具有邻苯二酚结构和烃氨基侧链，但其氨基侧链上取代基的差异可引起分子极性的改变，最终使得这类物质的色谱保留行为存在差异.目前常用的色谱分离固定相多为C18，而流动相多为磷酸缓冲液，有机溶剂与离子对试剂的加入对于分离效果有很大的改善.甲醇，乙腈等有机溶剂的使用可大大缩短分离时间，提高分离效率.辛烷磺酸钠等离子对试剂的加入可改变弱碱类物质的保留情况，改善分离效果. 李新玲[6]等研究了儿茶酚胺类(CAs)在Atlantis Cl8和Novle pak C18色谱柱的保留特性. 比较了流动相中离子对辛烷基磺酸钠(B8)浓度对CAs容量因子k’的作用，确认采用Atlantis Cl8柱分离CAs，色谱条件优化空间大.适于复杂生物样品分析.采用了Atlantis Cl8反相色谱柱，成功地分离了去甲肾上腺素，肾上腺素，多巴胺等CAs类物质. 勾凌燕[5]等建立了一种Oasis HLB固相萃取-高效液相色谱(HPLC)电化学检测大鼠血浆儿茶酚胺(CAs)的方法.以Atlantis C18 色谱柱为固定相，确定了各种影响色谱的参数，如流动相中机溶剂比例与离子对试剂浓度，pH范围及检测器的设定.儿茶酚胺所有组分肾上腺 ,,95,之间. 素(E)、去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA)的平均提取回收率在90 Moon Chul Jung[7]等以自制的C18填充型毛细管色谱柱为固定相，连接新型高灵敏度的光致发光检测器，实现了大鼠脑纹状体透析液中相关儿茶酚胺类物质的分离与实时监测.通过优化流动相中有机溶剂的比例和离子对试剂的浓度，在10%乙腈，10mM辛烷磺酸钠的条件下实现了6种生物胺类物质在6min之内完全分离.分离结果重现性良好，具有较低的检测限. 1.2 毛细管电泳法 毛细管电泳作为一种新的分离分析技术迅速得到人们的青睐，特别在有关药物学的领域应用最为广泛，是儿茶酚胺分析的一个新手段.采用毛细管电泳法，分离时间短，样品不需衍生，快速简便，重现性和线性良好，尤其表现在峰面积与浓度间的关系上，并且样品需求量低，一般仅需nL样品，适合微量样品的分析要求. 干宁等[8]建立了一种毛细管区带电泳(CZE)分离/安培检测左旋多巴(DP)、多巴胺(DA)、肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)5种儿茶酚胺类神经递质(CAs)药物的方法.通过用采用石英毛细管柱，含8mM/L对-(季铵盐)杯[4]芳烃(QAC4A)的125mM/L磷酸氢二钠溶液(Na2HPO4，pH 7.0)为缓冲液，分离电压6kV，实现了儿茶酚胺类物质的分离并利用Cu微粒修饰碳纤维电极检测.应用该方法成功地测定了5种CAs注射液、正常人和嗜铬细胞瘤患者尿样. 李欣欣[9]等利用毛细管电泳-化学发光联用技术分离测定了3种儿茶酚胺和儿茶酚，并优化了检测和分离条件.在最佳条件下,测得多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素和儿茶酚的检出限分别为0.33、1.8、2.4和0.12μM/L.此方法具有一定的选择性，也可用于医用注射液及尿样在未经预处理条件下的直接分离分析. 2 检测方法 2.1 电化学检测方法 儿茶酚胺类物质由于具有相同的邻苯二酚结构，因而具有较好的电化学活性.这一类物质的氧化电位均为+0.20V，单一的电化学检测方法难以实现高选择性的测定.目前，国内外有很多采用HPLC-ECD检测儿茶酚胺类物质的报道，分别检测肾上腺，组织样品，血浆样品中的儿茶酚胺类物质.在电化学检测过程中采用的工作电压多为0.40V-0.80V，工作电位越高，信号响应值越大，但也会引起无规噪音信号增加. 李炳源[10]等利用高效液相色谱电化学检测方法，实现了相关生物样品中儿茶酚胺的研究.定量学数据表明:检测限(S/N=3)在0.93,2.43pg以下，绝对回收率均?98.5%，样品日内相对差<1.2%.故此方法灵敏度高，重现性好，方法准确、可靠，操作简便，适用于生物组织，体液的微量儿茶酚胺类物质测定. 谢笑龙[11]等建立了一种关于血浆中儿茶酚胺的同时提取及HPLC-ECD测定方法.以有机溶剂提取，高效液相色谱-电化学检测器(HPLC-ECD)测定大鼠血浆NE、E的含量.结果测得NE、E的绝对回收率分别为:86.3?11.6%, 88.5?16.3%.线性范围0.04,4ng，批内与批间变异系数分别小于6%及7%.此方法具有简便、迅速、回收率较高的特点，便于应用，为有关药物作用机制的研究提供实验手段. 干宁等[8]毛细管区带电泳(CZE)实现CAs的分离，并采用Cu微粒修饰碳纤维电极进 行后期检测，该电极制作容易，对CAs催化活性高，且稳定性良好.优化条件下5种CAs被基线分离，回收率为92%-105%，5种CAs在0.2-1000μM浓度内呈良好线性关系，最低检测限为0.2μM.应用该方法成功地测定了5种CAs注射液、正常人和嗜铬细胞瘤患者尿样. 2.2 荧光检测方法 儿茶酚胺类物质本身有自然荧光，所以样品经前期分离后可直接进行荧光检测.但由于自然荧光相对较弱，一般需采用衍生化来提高检测灵敏度，采用的衍生化方法主要为柱后衍生化和柱前衍生化. 邓向军[12]等建立了一种高效液相-荧光检测法测定尿液中儿茶酚胺类化合物的含量.采用真空浓缩和真空干燥法对样品进行预处理，HPLC-FD测定，激发波长(EX):280 nm;发射波K(EM):316nm.结果表明重酒石酸去甲肾上腺素,重酒石酸肾上腺素，盐酸多巴胺在相关线性范围内，线性关系良好，回收率数据可用.并将此方法 测定尿液中CAs的含量，为CAs的测定提供一个更为方便而可靠的途径. 吴延晖[13]等采用HPLC-FL方法研究检测了化妆品中肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素的残留量.以Waters Atlantis Cl8柱，荧光检测器检测，激发波长为285nm，发射波长为340nm.结果表明，肾上腺素、去甲肾上腺素在0.025mg/L-2.5mg/L内，异丙肾上腺素在0.05mg/L-5.0mg/L内，其峰面积与质量浓度呈良好的线性关系且回收率良好.此方法为化妆品评审检验和卫生监督提供了有效的测试手段. 2.3 化学发光检测方法 儿茶酚胺类物质结构中的酚羟基可与多种化学发光试剂发生氧化还原作用，影响光信号的强度.因此，化学发光检测方法作为一种高灵敏度的分析方法也广泛地应用于儿茶酚胺的检测中. 李欣欣[9]等根据儿茶酚胺类物质及儿茶酚能淬灭铁氰化钾-鲁米诺体系发光的原理，用毛细管电泳-化学发光联用技术分离测定多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素和儿茶酚.在2.0mM鲁米诺，0.1mM铁氰化钾，pH13.3的条件下，实现了儿茶酚胺类物质的精确测定.此方法选择性较好，对医用注射液及尿样可直接进行分离分析，无需预处理. Edyta Nalewajko[14]等根据儿茶酚胺类物质在碱性环境中能抑制鲁米诺-碘体系发光的原理，建立了一种高效液相色谱-化学发光连用的技术测定L-多巴，多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素.此方法灵敏度高，选择性好，可用于相关药物与尿液样品中的儿茶酚胺类物质检测. 2.4 其他检测方法 随着分析仪器的不断更新与新型分析方法的陆续提出，越来越多的新检测手段应用于儿茶酚胺类物质的研究中，其中最为瞩目的两种方法分别是质谱和光致发光测定方法. Victoria Carrera[15]等建立了一种新型的HPLC与常压的化学电离源MS相结合的方法测定多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素和5-羟色胺.此方法操作简单，无需繁琐的样品前处理过程，并可用于间接研究杀虫剂对于牛嗜铬细胞的毒性作用以及其对于此类细胞的神经递质分泌功能的影响. Moon Chul Jung[7]等将毛细管HPLC与新型高灵敏度的光致发光方法相结合，实现了大鼠纹状体透析液中儿茶酚胺类相关物质的准确测定与实时监测.此方法重现性良好，检测限低至pM级别.通过此方法可实时地观察河豚毒素对于鼠脑中儿茶酚胺类物质分泌代谢情况的影响. 3 小结 儿茶酚胺类物质作为生物体内重要的神经递质与激素，参与到中枢和外周神经系统的神经信号传导过程中并起着十分关键的作用.目前，生物，生理，化学等领域的研究者越来越注重对儿茶酚胺类物质的深入研究，而采用操作简单、高选择性、高灵敏度的分析方法是得 出准确结果的前提.检测儿茶酚胺类物质的方法很多，其中使用最为广泛高效液相色谱同电 化学检测、荧光光度检测方法相结合.高效液相色谱-电化学方法能在生物样品分析中大放光 彩，是由于其具有高选择性与高灵敏度，能减少但不能彻底消除药物干扰.由于许多分析方 法在灵敏度、选择性及分析速度等方面达不到样品分析的要求，从而不能在实际生物样品检 测中推广应用.所以发展实时、高通量、高灵敏度的儿茶酚胺类物质分析方法是未来几年的 必然趋势.近几年发展起来的微流控芯片电泳-电化学检测方法[4]大大提高了灵敏度与特异 性，能快速检测尿样与血样中的儿茶酚胺类物质，其灵敏度与特异性足够用于探测大多数与 儿茶酚胺类物质相关的肿瘤. 参考文献: 〔1〕高菲，杨红生，许强，等.双壳贝类血淋巴中儿茶酚胺的检测方法初步研究[J].海洋科 学，2006，30(1):28~33. 〔2〕黄彦，曹蓓截，邱一华.淋巴细胞合成和释放儿茶酚胺的高效液相色谱检测[J].南通大 学学报(医学版)，2007，27(6):502~504. 〔3〕贾贞，刘淑芳，孙长侠，等.儿茶酚胺电化学分析法的研究进展[J].德州学院学报(自 然科学版)，2004，20(4):51~55. 〔4〕顾群，石先哲，许国旺.生物样品中儿茶酚胺类物质分析方法的研究进展[J].色谱，2007， 25(4):457~462. 〔5〕勾凌燕，刘景东，王憬，等.固相萃取-高效液相色谱电化学法检测大鼠血浆儿茶酚胺 [J].分析试验室，2006，25(1):90~94. 〔6〕李新玲，李炳源.儿茶酚胺类物质在Atlantis C18反相色谱柱保留特性的研究[J].交通 医学，2006，20(5):629~631. 〔7〕Moon Chul Jung, Guoyue Shi, Laura Borland. 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