重度子痫前期胎盘组织中MicroRNA的表达谱研究（可编辑）

重度子痫前期胎盘组织中MicroRNA的表达谱研究（可编辑） 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。掘我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得直昌太堂或其他教育 机构的学位或证而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 日 学位论文作者签名手写:弓亩影、签字日期: 山一年月 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定,有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借 阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位 论文。同时授 权中国科学技术信息研究所和中国学术期刊光盘版电子杂志社将本学位论 文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据 库》中全文发表,并通过网络向社会公众提供信息服务。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 , 儿 学位论文作者签名手写: 影二 奎名 汗手 煽秀 ?? , .. 幽咱 字 期 年 ’、月引 同 占 写? 签字同期:山垆名月一日摘要 摘要 目的: 子痫前期是一种多因素多基因性疾病,目前国内外关于基因的研究热点趋 向于渊对靶基因转录后水平的调控,本研究诣在筛选重度子痫前 期与正常 妊娠胎盘组织中差异表达的八谱,并分析部分与重度子痫前期的 关系。 : 、收集年月至年月在江西省妇幼保健院行剖宫产分娩的 例重度子痫前期和例正常妊娠的胎盘组织。 、液氮研钵法提取总用紫外分光光度仪测定法和甲醛变性琼 脂糖凝胶电泳法检测总的浓度、值、纯度和质量。 、采用标记试剂盒 标记样本.版本包括 个捕获探针, ,与第代 覆盖数据库.版本人、小鼠、大鼠三种物种全部,同时覆盖 与上述三种物种相关的所有病毒的杂交并洗涤后用 .进行原始数据分析并用软件 芯片扫描仪扫描。用 进行差异表达筛选以值.和 值?.或茎.为条件 及聚类分析。 结果: 、芯片结果的聚类分析显示:重度子痫前期与正常妊娠胎盘组 织共存在个差异表达的,且个在重度子痫前期胎盘组织 中表达显著上调。 、其中一已证实在重度子痫前期胎盘组织中显著差异表达,除此 之 外,本研究新发现一些异常表达的如一,.,.,. 笙 寸 结论: 芯片可以快速高通量分析重度子痫前期胎盘组织相关的 表达谱,通过芯片筛选出差异表达的有可能成为新的重度子痫 前期特征性的生物学标志物,并可进一步认识和研究其在重度子 痫前期发生发摘要 展中的作用,为寻找临床诊治重度子痫前期相关分子标志物和治 疗靶点奠定基 础科学依据。 关键词:子痫前期,胎盘,,表达谱??????????????尘堕堕一 : ’ ,. . . , : . 、? 矗,. . . .刑 , ‘“ ,, 氏., . , . . 芝.. . : 瑚 , . , ,。 ,。 ,. : ? .’ ,,. :?,,, 目录 目录 第章引言? 第章材料和仪器? .组织? .实验试剂.. 提取试剂 .. 质量检测试剂? ..标记试剂盒?一 .. 芯片杂交与洗涤试剂盒?一 .. 芯片 实验仪器第章实验方法.研究对象与实验标本 ..胎盘标本采集 .总提取与质量检测..提取胎盘组织总 ..总质量检测?一 . 样本的荧光标记. 芯片杂交.. . 芯片扫描和数据分析? 第章试验结果.样本纯度及质量检测 . 电泳结果??一 . 芯片扫描结果局部放大图例? . 芯片数据统计分析..低强度过滤和数据化一 .. 数据的质量评估? .重度子痫前期与正常妊娠胎盘组织差异表达的筛选? .重度子痫前期与正常妊娠胎盘组织差异表达的聚类分析目录 第章讨论一 第章结论一 致谢一 参考文献攻读学位期间的研究成果? 综述?一 中英文缩略词表 中英缩略词表 英文缩写 英文名称 文名称度子痫前期 ? 皮型一氧化氮合酶中重内绒毛外细胞滋养细胞微小信使 的初级转录产物 . 前体 ? ’一 ’? ’非编码区 ? 诱导沉默复合体. 人类白细胞抗原 血管内皮生长因子 焦碳酸二乙酯 磷酸盐缓冲液转化生长因子. 一 核糖核酸酶 乙二胺四乙酸 可溶性内皮因子 . 基质金属蛋白酶 第号染色体同源丢失性磷酸酶一张力蛋白基因上皮细胞一问质细胞转变 ? / 磷脂酞肌醇一经基激酶 一 / 促凋亡的.同源结构域 唯结构域蛋白 一 第章引言 第章引言 子痫前期?是妊娠期特有的疾病,以妊娠周后出现高血 压、蛋白尿、水肿为特征,其病理改变主要是全身小动脉痉挛,周围血管阻力 增加,导致各个脏器的血流量减少,其发病率约%~%?,而重度子痫前期和 子痫在欧洲发达国家发病率.%~.%~在发展中国家达.%~.%引。 它能引起母婴严重的并发症,可导致急性肾衰、心衰、脑血管意外、胎盘早剥、 胎儿生长受限、胎儿窘迫等,并造成全球每年约例妊娠妇女死亡【,目前 处于我国孕产妇死亡因素的第二位。随着产检的普及及剖宫产技术的提升,全 世界范围内重度子痫前期和子痫逐年减少,美国?的一份调查 盯显示先兆子痫前期发病率接近,其发病率在过去年内逐年呈大幅度 下降趋势。但因重度子痫和子痫的发生导致剖宫产率急剧上升,在拉丁美洲剖 宫产率达%,个剖宫产患者中有个是重度子痫前期或子痫患者,剖宫产 率的风险远远超过重度子痫前期和子痫的风险懈。 子痫前期是中多基因性疾病,发病机理至今尚未完全阐明。从基因水平 看,子痫前期关于胎盘血管生成研究甚多,如由胎盘释放的细胞因子,细胞滋 养细胞释放的具有生物活性的细胞碎片及一系列抗血管生成因子,包括可溶性 内皮因子,可溶性血管内皮生长因子受体.。等研究发现在子 痫前期外周血中的表达呈上升,且升高与子痫前期严重程度呈正相 关。通过转录因子如调节基因转录,由基因编码的.因子在 胚胎的发育过程中对细胞的生长、分化及增殖起促进作用? 等?.人通过 体外实验可了解到整个妊娠过程内皮细胞基因表达的变化,并指出子痫前期可 能是通过.相关信号通路而致病。除此之外,人类还利用生物学技术发现 了很多关于与子痫前期有关的基因,如细胞凋亡的基因、与免疫机制 相关的人类细胞抗原、与内皮细胞损伤有关的内皮型一氧化氮合酶 、与胎盘滋养细胞凋亡及抗凋亡相关因子和一等。尽管如此, 这些基因与子痫前期发病之间的关系仍很微妙。 目前关于子痫前期发病学说有遗传易感学说、免疫调节学说、血管内皮损 伤学说、氧化应激学说、胎盘浅着床学说等。但从临床治疗方面可以看出胎盘 娩出之后该病的相关症状能迅速缓解,提示胎盘在发病中起了重要作用。近第章引言 年来越来越多人学者认同胎盘滋养细胞功能障碍是的发病基础,胎盘“浅 着床”,主要是因为胎盘滋养细胞分化和功能异常使滋养细胞浸 润能力受损,无 法完全重塑螺旋动脉而影?‘ ?盘血供,造成胎盘缺血、缺氧,释放出许多细胞 毒性因子进入外周血循环,造成广泛的血管内皮细胞损伤,以及机体的多脏器 损伤,胎儿缺氧致生长受限。主要发生在中晚期可能是因为胎儿的需求量增 加,母体无法代偿出现一系列临床症状。目前治疗的最佳方法是终止妊娠, 势必带来早产儿出生率急剧升高,围生儿生存率降低。目‘右床上发病前可 做一些早期预测并进行有效干预治疗,如平均动脉压测定、小时动态血压检 测、翻身实验、血液流变学实验、尿钙测定等。如何利用生物学手段发现一些 能够早期诊断和帮助早期诊断的相关分子标志物,并对其进行分子靶向治疗 仍是一个很长远的研究。 近年来,随着分子生物学的快速发展,人类已在年完成基因组序列绘 制,目前基因研究热点开始转向靶基因转录后水平的微调控一。 是一类大小约的非编码内源性,通过与靶的 非翻译区结 合来促进靶的降解和或抑制翻译,在转录后水平发挥基因沉默效应, 约有/受的调控。主要参与多种生物学过程的调控,包括个体发 育、组织分化、细胞凋亡以及免疫调节的发生,它广泛存在真核生物体内,在细 胞核内,基因组转录生成较长的?,之后被酶切割形成长 度大约? 、具发夹结构的?。这些发夹结构的.被核 输出蛋白转运到细胞质,被胞浆中的酶切割形成大小 的成熟的产物。具有进化高度保守性、表达时序性、组织特异 性、基因簇集性等生物学特征。研究结果的多样性提示,在不同的细胞类型当 中,不同的发育时段,或者对于不同的靶,可能通过不同的机制 发挥作用。且每个可调控数百个基因的表达,而多个也可协同 调控一个靶基因,与靶基因形成了一种复杂的基因调控网络。年 等【 】首次在秀丽隐杆线虫中发现控制线虫时序性发育的基因一,后续大 量关于研究发现还参与了人类多种疾病的发生和发展如癌症、 心血管系统疾病、内分泌系统疾病等【 。研究【 显示,胎盘中的主要来 自于灵长类特有的一个基因簇,大部分位于染色体.,提示与胎 盘的发育密切相关。重度予痫订期胎盘植入过程中存在胎盘“浅 着床”,即胎盘 细胞滋养细胞侵入蜕膜能力下降,导致血管重铸障碍,从而造成胎盘缺血缺氧 第章引言 而出现一系列临床症状,甚至引起子痫前期病情恶化。可通过介入细胞 周期、细胞凋亡、血管生成等环节影响重度子痫前期胎盘的发育过程,而血管 重铸与血管内皮生成因子相关基因的结构和功能密切相关,表现为血管内皮生 长因子的激活或抑制。综上所述,的表达失衡与重度子痫前期的发生有 着极为密切的关系。 芯片是一种快速高通量筛选的有效方法,能短时问内筛 选出所有已知的,其应用为重度子痫前期胎盘组织中筛选及鉴定 方面提供了重要技术支持,成为研究重度子痫前期发生、诊断和治疗及寻找新 的生物学标志物的一条重要途径。本研究采用代 ?.版本的的微阵列芯片方法对例重度子痫前期和例正常 妊娠胎盘组织进行检测,研究重度子痫前期和正常妊娠胎盘组织中的表 达特点,寻找两者差异表达的,并探讨其在重度子痫前期发病中 的内在机 制,从而为后续寻找潜在的与重度子痫前期发病相关的分子标志物打下基础, 并为重度子痫前期的治疗提供指导依据。 第章材料和仪器 第章材料和仪器 .组织 选择我院年月至年月剖宫产分娩的例孕妇胎盘作为研究 对象,其中例为重度子痫前期患者研究组,例为正常分娩的产妇对照 组,排除合并先心病、慢性高血压、慢性肾炎、糖尿病等合并症。所有的产妇 皆随诊至产后周,例组织送往上海康成生物技术公司协助芯片 检测及数据分析。 。实验试剂 .. 提取试剂 美国公司 ?水 氯仿上海化学试剂有限公司 异丙醇上海化学试剂有限公司 无水酒精上海化学试剂有限公司 .. 质量检测试剂 焦碳酸二乙酯美国公司 美国公司 甲酰胺,美国公司 溴酚蓝美国公司 甲醛上海化学试剂有限公司 琼脂糖上海生工工程有限公司 .。标记试剂盒 标记试剂盒,丹麦 / 第章材料和仪器 。。 芯片杂交与洗涤试剂盒 杂交缓冲液 清洗缓冲液 ..芯片 采用丹麦生产的.版本芯片,该芯片包括个捕 获探针,覆盖数据库.版本人、小鼠、大鼠三种物种全部的, 同时覆盖与上述三种物种相关的所有病毒的。此外,该芯片包括 个 数据库之外人类捕获探针,每种探针重复次。 .实验仪器 超净工作台苏州净化设备公司 台式低温冷冻离心机德国公司 台式高速离心机德国公司 紫外分光光度计美国?公司 自动恒温水浴箱天津泰斯特仪器有限公司 凝胶成像及分析系统美国.公司 核酸电泳仪美国?公司 微波炉美的电器公司 涡旋震荡仪上海金达公司 杂交箱 一 芯片扫描仪 ,美国公司.软件 杂交盒装置 第章实验方法 第章实验方法 .研究对象与实验标本 本研究所有的实验标本均患者知情同意,并符合人权研究委员会 “赫尔辛 基宣言”伦理之指南规定。 ..选择我院年月至年月剖宫产分娩的例孕妇胎盘组 织作为研究对象,其中例为重度子痫前期胎盘组织研究组,例为 正常妊 娠胎盘组织对照组,研究对象的临床特征。如表 重度子痫前期诊断根据年版妊娠期高血压疾病诊治指南标准,子痫前 期患者发生以下任何一种不良情况可诊断为重度子痫前期:?血压持续升高:收 缩压? 和或舒张压? ;蛋白尿./或随机尿持续 以上;?血小板持续下降伴血小板/,血管内溶血、贫血、黄疸 或血升高;?持续性头痛或其他大脑或视觉障碍;?持续性上腹部疼痛; ?肝脏功能异常:肝酶或水平升高;?肾脏功能异常:少尿尿 量或每小时尿量或肌酐/;?低蛋白血症伴胸水和腹水; ?心力衰竭和肺水肿;?胎儿生长受限或羊水过少等标准。 正常妊娠诊断标准:?自然受精,妊娠期间顺利;?血压/; ?无蛋白尿,水肿,黄疸、贫血等。 病例纳入标准:?未进入产程,终止妊娠孕周在周至周之间;?经 剖宫产分娩结束,单胎,在分娩结束之前未行任何治疗;?无其它妊娠合并症。 病例排除标准:?慢性高血压病史,心血管疾病史;?糖尿病、肾病、肝 炎、系统性红斑狼疮等免疫性疾病,抗磷脂综合征;?贫血及血液系统疾病;? 其他病理妊娠如前置胎盘、胎盘早剥、肝内胆汁淤积征等;?死 胎、胎儿畸形等; 第章实验方法 研究对象的临床特征比较表 标本号 住院号 组织 年龄 孕龄 孕产汝 收缩压 舒张压 胎儿俸重诊断 分娩方式 岁 周 删胎盘刮宫产啪 胎盘刮宫产 胎盘 惭 刮宫产 胎盘 哟 刮宫产 胎盘 啪 刮宫产胎盘 啪 剖富产胎盘 正常 刮宫产胎盘 正常 刮宫产 胎盘 正常 刮宫产 胎盘正常 刮宫产 胎盘 岵 墨兰正常 刮宫产 代表,代表正常妊娠。 ..胎盘标本采集 采集胎盘的器具皆应去酶,保证提取的总符合芯片杂交要求: ?研钵、研棒、药匙、玻璃器皿等需在。烘干以上; ?电泳槽、胶板、梳子,用.%~.%水处理过夜,然后用 冲洗干净,晾干备用; ?离心管,枪头等塑料器皿要用.%.%水处理过夜有致癌 之嫌,须小心操作,所有溶液都需用经处理过的水配置,提取的所有 操作应尽可能在超净工作台上进行。 ?一次性手套 剖宫产术胎盘娩出后,于母体面胎盘中央避不钙化灶区,剪下面积约 全层胎盘组织,用去核酶的清洗并用无菌纱布擦拭水分,装入冻存管直接 放入液氮速冻过夜后置入一。冰箱保存。 .总提取与质量检测 ..提取胎盘组织总 、将研钵遇冷,往研钵内反复加入液氮,至少?次,使研钵充分预冷。 第章实验方法 从.?冰箱中取出标本,迅速切取一块组织样品约?,切取过程严 格按照无核酶标准执行,操作用具应严格消毒,配带口罩和手套,要求操作环 境干净整洁,放入已遇冷的研钵中进行研磨至粉末,边研磨边加液氮,以免组 织冻融。 、加入 继续研磨至匀浆, 转入.的离一管中,×离 心分钟,收集上清至新离心管中,室温静置分钟,以便核酸酶蛋白复合体 完全解离。 、加入氯仿.:氯仿:,盖紧管盖,剧烈震荡~秒,使溶 液充分混匀,室温放置分钟。 、在恒温。 ×离心,提取水相层约为的%, 完全溶解在水相层,下面含无色的中间层和下层红色的酚氯仿层,加入等体积的 异丙醇.,颠倒混匀后至一?的冰箱小时或过夜,可见絮状物形成。 、恒温。×离心,见管底形成白色絮状物沉淀,移去上清, 加预冷的%乙醇?配置洗沉淀,恒温。×离心, 弃上清,重洗涤一遍。 、去除乙醇后,空气中干燥沉淀至半透明,加入无核酶水反复 吹打或。~。孵育,溶解后将保存至.。冰箱。 ..总质量检测 .紫外吸收测定法测定在波长和的吸收值,获得 的浓度并通过/及/的吸收比值判断的纯度。/比 值在..之间,表明提取的未污染。 .用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,检测纯度和完整性。 .%琼脂糖凝胶配制:.琼脂糖,置干净的锥形瓶中,加入 蒸馏水,微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。待胶?至?。,依次 向 其中加入甲醛、 缓冲液和.溴化乙锭,混合均匀。 取样品在.%琼脂糖凝胶,于,的电压下电泳 电泳结束后,?凝胶成像系统摄像,通过和的亮度比 例初步评价总得质量,:?判定总质量较好。第章实验方法 . 样本的荧光标记 、提取结束之后,按照 标记试剂盒 / 说明书进行荧光标记。 、预先将试剂盒中所有试剂在冰上融化后微离心后按下表配置反 应液: 成分 体积? . 总 缓冲液 . 酶 . . 无核酶水 、将混合物置?孵育,结束后将离心管放置恒温。 终止 酶反应。 、迅速置冰上冷却,按下列表配置向混合物中加入: 成分 体积. . 第步混合液 . 标记缓冲液 . 荧光标记 . . 荧光标记酶 、将反应液置。孵化后置。下终止反应,放置。冰箱备 后续杂交反应使用。 . 芯片杂交 、采用丹麦生产的.版本芯片,该芯片包括个捕获探针, 覆盖数据库.版本人、小鼠、大鼠三种物种全部,同时覆盖 与上述三种物种相关的所有病毒的。此外,该芯片包括个 数据库之外的人类捕获探针。 、取一.去核酶的管,向其加入:之前配好的标本反应液, .杂交缓冲液,充分混匀后置。避光孵化,然后置冰上冷却。 、小心取出载玻片与芯片,将芯片置于载玻片问隙上方,注意有点样一面 面向载玻片,做成 矩阵杂交组合。 、取出杂交袋将第三步制作好的 矩阵杂交组合 第章实验方法 套住,开口用绳子捆紧,将杂交袋迅速放入。水浴中加热~,使杂交袋迅速 预热收缩紧紧包裹 矩阵杂交组合。 、擦净杂交袋的水分,将杂交袋多余的薄膜修剪,并放入。烘箱中约 。 、沿开口端将杂交混合液注入杂交袋中,再使用杂交缓冲液补充加 至液面距顶端约.。 、用另一个杂交袋减去一半后反向套住第一个杂交袋,开口端用绳子捆 紧,迅速放入?水浴中加热~。使 矩阵杂交组合 成为一个密闭的反应空间。 、密闭的杂交装置取出后置。烘箱烘干并减去多余的杂交袋薄膜,后放 置在?杂交炉里旋转杂交过夜。 、结束之后,反复用清洗缓冲液清洗芯片,最后离心晾干。 使用 芯片扫描仪进行扫描。 . 芯片扫描和数据分析 、采用 扫描仪对 例样本的芯片进行扫描获得 荧光强度并将其转化成数字型数据保存。 、将数据输入 .软件进行分析运算。低强度信号筛选和数据 标准化:先对原始数据进行信号值去除背景预处理,并将个重复探针取平均 值。 、采用中位数值法对每张芯片信号值%的探针进行标准化,以该部分探 针中位值作为标准化因子对整张芯片的信号点做标准化处理,标准数据本底相 减/中位值。 、经过标准化后的数值,采用方法计算出的差异表达,一般 认为 筛选差异表达?.或茎.倍且 .认为是显著差异表 达的。 、对有差异表达的进行分层聚类分析。 第章试验结果 第章试验结果 .样本纯度及质量检测 使用分光光度计测定各标本浓度合格,/比值皆在.之间。 表 分光光度仪检测标本质量 ; 一? ?伽晒如胆叩囝如, .?酗/ . . 。 . 口 。 . . . . . 。 . . . . .. . . . . . 。 . : . . . . . 。 。 . . . . .. . 。 . . . . ?如?加??加如如? . . 电泳结果 盯 地: 址:耻弧 地: 扯:诅砒呛 :试 ? 址:协 扯: 地:协 扯: 扯:协 扯:乜 图.琼脂糖凝胶电泳显示和核糖体条带,比较弱,表明质量及纯度 合格,可用于芯片杂交。 第章试验结果 . 芯片扫描结果局部放大图例 第章试验结果第章试验结果 图.芯片荧光扫描图:、、、、为正常妊娠胎盘组织对照组。、、 、、、为重度子痫前期胎盘组织研究组。 图中绿色荧光信号代表在该处检测到可能有的表达,荧光信号的 强弱代表 表达的水平。 . 芯片数据统计分析 ..低强度过滤和数据标准化 将数据输入 .软件进行分析运算,去除背景噪音,取平均值 后采用中位数法对每张芯片信号值%的探针进行标准化后部分数 据表达。 表 中位数法标准化后部分数据的表达... ... . ... . . .... .... . ... . .. ?. . . .. ?.. .. . . .. . .. . . ... . . . . . . . . . . .. . .. 。 . .. .. . . . .. . . .. . . . . . .. 数据的质量评估 箱线图 法能以方便快速的方式评价数据集的分布,是比较样本 最有用的分布。如图,归一化后,得到比率的分布在每一个样品几 乎是相同的。, 第章试验结果 图左:非归一化得到的数据:右:中值归一化得到的数据 轴为信号强度;轴为样本号 散点图 可以显示对照组及重度子痫前期组标本间差异性的存 在,使用中位数法测对照组及重度子痫前期信号杂交情况的相关 系数.。 说明对照组与重度子痫前期组问存在明显的差异。 图.对照组与重度子痫前期组样本相关关系分析图 第章试验结果 .重度子瘸前期与正常妊娠胎盘组织差异表达的筛选 经过中位数法标准化后。将重度子痫前期和正常妊娠组进行对比, 计算出 各的差异倍数.,筛选出上调和下调的。按照差 异倍数?.为显著上调.为显著下调为标准,且的值.变化的 为有统计学意义。芯片结果表表明与正常胎盘相比,胎盘组织 中共存在个表达显著上调。 表重度子痫前期胎盘组织中显著上调的 名称 名称 . . . . . ? . 。. . . . . . . . . . .. . . . .. .. . . . . . ? . . . . . ? ?. . . . . . .. .. .. . . . .. . . . . . . . . . .. . . .. . . . . . . ... . .. . ? 一 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . ? .. . . . . . . ? . . . . . . . .. .. .. . . . . 一 . . . . ? .第章试验结果 .重度子痫前期与正常妊娠胎盘组织差异表达 的聚类分析 个显著差异表达的进行双向聚类分析图,每一行代表一种 ,每一列代表一个样本,聚类树左边显示,样本聚类树出现在顶 部,聚类树出现在右边。红色代表较高的表达量,绿色代表较低的 相 对表达量。 礤寰曩??????????????????????????融 ? 一 ’一 、‘ ‘: .二 ? ‘ ’ 畸 一 ??????????????? 图.谱的热力图:上方数字为标本号,红色代表上调,绿色代表下调 、、、、代表是对照组,、、、、、代表是组。 第章讨论 第章讨论 是一类长约~的单链内源性非编码的微小,与靶基因 相关位点结合后,通过降解靶基因或在转录后水平抑制靶基因的翻译, 达到抑制靶基因蛋白的表达。主要参与细胞增殖、凋亡、发育和逆境应 答等多种生理和病理过程。最早是在年等【】首次在秀丽隐杆 线虫中发现控制线虫时序性发育的基因.。随后大量关于的研究表明 参与了胚胎的发育、骨骼发育、脑和神经系统发育肿瘤的形成与转移等。 目前计算机预测人类基因组已编码过的超过个,的重大发 现揭晓了基因非编码区存在一种新的重要调控机制。芯片能快速高通量 筛选与发病相关的,由于已知的种类有限,此芯片不能发现一些 未知的与发病相关的,目前此芯片已经在不同的组织、不同的发育阶段 检测,成为研究的重要科学技术。 重度子痫前期的发生发展是一个多因素、多阶段、多基因变化的过程。其 发病主要在于胎盘滋养细胞功能障碍,侵蚀血管能力下降,螺旋小动脉生理重 铸失败,造成正常母.胎氧及营养供应能力下降。近年来与妊娠相关的 研究也愈来愈多,妊娠结局与胎盘的生长发育有着密不可分的关系。很早就有 报告证实在小鼠和人的胎盘组织中广泛及特异性地表达【】。 等 利用特异的寡核苷酸芯片系统,定量检测了个在人类胎 盘、胸腺、睾丸等组织中的表达,首次发现有二十余种已知的在人的 胎盘组织中表达。在早产胎盘中也有些研究,在早产及足月产胎盘中存在的 个差异表达中,其中个在足月产胎盘中表达下斟】。在妊 娠高血压疾病研究中 等应用荧光实时定量技术检测了与正常胎盘 中的个的表达,发现与正常胎盘相比,胎盘中存在显著表达差 异的,,第一次的表达失衡可能参与 了的发病过程【。 】进一步采用芯片检测的个在轻度和 重度子痫前期及正常人胎盘组织中差异表达的中个表达上 调,个表达下降,其中在子痫前期中表达显著增高,与 的研究结果相符合,但其中在子痫前期中表达显著下降,与本 实验结果中表达显著增高恰好相反,可能是由于芯片上信息排列顺序 第章讨论 瞄等 或实验分组标准不同,或者纳入研究对象的参考孕周不同等。另外 运用芯片检测并运用荧光定量验证子痫前期及正常人胎盘组织中 差异表达的个,其中个一,,,一, 一,。等表达上调,个.,.,.,一 ,一,一,.表达下调。本实验中.在子痫 等运用含 前期胎盘组织中显著增加,与 等的结果一致。同时 个探针的芯片检测出子痫前期胎盘组织中共个表达差异的 ,其中个.表达上调,个。,一,.等 表达下降,此结果与本实验结果无重复表达的。 本实验采用第代 ?.版本的表达谱 芯片检测与正常妊娠胎盘相比,胎盘组织中存在个表达显著上调的 、一、一 、、 ,包括.. ..?、..、?.等。芯片筛选出差异表达的 芯片研究结 有待进一步进行荧光定量验证。通过与国内外关于 果相比,由于使用生产的.版的芯片包括个捕获探 针,覆盖数据库.版本人、小鼠、大鼠三种物种全部,同时 覆盖与上述三种物种相关的所有病毒的,使得检测范围大大增加,本 实验结果筛选出很多之前研究未涉及的,其在整个疾病分子水平的功能 尚未确定,大大丰富了胎盘中的差异表达谱系,进一步验证了等实 验结果,为差异可能参与子痫前期发生发展提供了新的证据。 其中最值得注意的是一,在包括本研究在内的多个子痫前期研究中, .的表达上调都是十分明显。一在染色体位于 .,距 一,其生物学功能与.类似。目前关于一的研究越来越 广泛,参与各种组织和系统的发育,如:在造血系统分化【中一可直接 抑制.?和基因保障红细胞的正常分化。还参与上皮细胞极性【,胚 胎成熟【】,神经系统发育【等。同时也参与各种疾病的发生发展,如肺动脉高 压【”,心肌梗死【,低氧引起滋养细胞的改变【,胶质瘤‘等肿瘤的侵袭和转 移等。【等在胶质瘤研究中证明过表达.在、细胞中, 可以抑制细胞的增殖,转移能力,他们认为一是通过调节、.、 一来完成它的生物学功能。一是家族重要的抗凋亡蛋白, 等 发现胎盘一低表达与妊娠期高血压疾病有相关。有研究【 表明,正常晚 第章讨论 期妊娠与妊娠期高血压疾病胎盘细胞滋养细胞和合体滋养细胞中都有一定量或 较大量的细胞凋亡发生,说明细胞凋亡参与了正常妊娠胎盘的生长发育和绒毛 组织结构的改建及功能的完善,当凋亡的“抑制.促进.平衡”被打破时,可能会导 致病理妊娠的发生。等【 对胎儿生长受限和严重先兆子痫的孕妇胎盘进 行了研究,发现孕妇合体滋养层细胞细胞凋亡增多,并且凋亡率明显增加,表 明子痫前期胎盘滋养细胞凋亡过度,导致滋养细胞的浸润能力下降,血管重塑 异常,导致胎血缺氧,加重子痫前期疾病的发展。。是滋养细胞侵蚀的重 要生化介质,是细胞外基质讲解重要的调节者,其参与胎盘的整个发育过程, 维持正常的妊娠。张弘【等人在子痫前期的研究中发现,促浸润基因一基质金属 蛋白酶.在子痫前期的胎盘组织中的表达下降,与子痫前期的发病有关。 顾芸【等研究发现,正常妊娠的胎盘组织中一表达明显,而在妊娠期高血 压疾病患者表达偏低,妊高症患者血浆中一水平显著低于正常对照组。胎 盘是子痫前期发病的根源刨,子痫前期患者胎盘中的滋养细胞对子宫螺旋动脉 侵蚀不足,影响胎盘的血管重铸。研究【 表明,.是胚胎滋养细胞侵入过 程的限速酶。由滋养细胞分泌一,其分泌量决定了滋养细胞对子宫肌层的 浸润程度和血管重铸,由此可见一表达量及活性的变化影响滋养细胞侵袭 能力,这可能是导致子痫前期发病的重要因素。结合本实验中子痫前期患者胎 盘中.表达量增高,是否通过调控.、一参与子痫前期的发病 值得进一步探讨。 .与?、一构成。一基因簇,该簇染色 体定位于.。在本芯片表达谱中.表达显著增加,说明.可能 参与了的发病。一在目前研究中主要涉及肿瘤领域,包括头颈部鳞 癌‘、结肠直肠癌网、髓母细胞瘤四、食管癌?、胃癌蚴、肝癌删等,并有研 究【】指出可以将一作为非小细胞肺癌诊断的一种血清标志物,其靶基因主 要与局部粘附有关。有研究【表明.可以调控细胞周期抑制因子 参与肿瘤细胞的周期进展。在食管癌细胞中过表达一可以抑制细胞凋 亡】,而在肝癌中,抑制.的表达却不能增加肝癌细胞的凋亡其差 异可能与组织分化来源不同造成的。目前实验已经证实促凋亡因子 是.的靶基因,所以一主要是通过调控抑制癌 细胞凋亡【。是一信号通路下游效应分子,在早期胚胎形成中? 在上皮和间质转化过程中起到重要作用,通过诱导整合素及细胞外基质的表达 第章讨论 存进胚胎的发育,.与其受体结合参与信号传导,在血管生成中具 有重要的 作用,同时可以增强依赖的血管舒张。在胶质瘤研究【副中,.可以 认为是通过抑制的表达活化/的通路,促进胶质瘤细胞的恶性生 长和侵袭。作为新的抑癌基因在非肿瘤性疾病中的疾病甚少, 对胚胎发育也有重要作用,失活的胚胎在早期即可死亡【。在心血管疾病 研刭中,通过/信号通路作用于血管内皮细胞,调节血管内皮 生长因子,在高血压疾病中起重要作用。是介导氧化应激性反应负向调 节最关键的激酶之一,是刚信号通路的调控者,拮抗的生 物活性,参与胎盘缺血再灌注氧化应激反应的调控【 。同时,胎盘中细胞滋养 细胞类似于肿瘤细胞样侵蚀母体蜕膜、浅肌层和相应子宫螺旋动脉,二者生物 学行为有相似之处。作为抑癌基因有可能对滋养细胞的侵蚀有重要的调控 作用。有研究报道岭引,在重度子痫前期胎盘组织中表达明显低于正常胎盘 组织,提示病情越重表达量越低,但其作用机制不明确。本研究中 表达显著上调,根据上述和负向调控基因原理,.可能通过激活 /信号通路负向调控参与胎盘缺血一再灌注反应。 一是位于两个染色体区域,..是位于染色体., ..位于染色体。既往研究.在胃癌、肺癌、膀胱癌、前列腺 癌、宫颈癌等肿瘤中表达下降,并能抑制肿瘤的侵袭和转移。通过生物信息学 靶基因预测发现是一的靶基因,转录因子家族主要包括、 、、,其中参与了多种肿瘤的发生发展并调控多种基因表达,如 、、、钙粘附因子和等。同时、和协同调控 和的表达促进癌细胞的增殖【。.靶向调控抑制结肠 癌的发生发展可能就是通过抑制、、等基因表达实现【 。子痫 订期胎盘组织中关于的研究甚多,现已证明在子痫前期较正常妊 娠胎盘组织表达明显下降【?。而重度子痫前期患者血清中的表达水平升 高,或者是降低的【圳,目前关于在重度子痫前期发病机制中的作用未 明确,需要进一步的研究。结合本研究中一在表达呈显著上调,是 否通过靶向调控在胎盘表达下降需要进一步研究。 此外,一是一种上皮组织特异性表达的,位于.,通过 诱导并促进分化,参与皮肤的发育及功能维持,在皮肤中起重要调控作用。 同时一有促进肿瘤细胞凋亡的作用均?,其通过靶向上皮一问质转化 第章讨论 ,抑制肿瘤的转移和侵袭,在肝癌扣、 膀胱癌【引、淋巴细胞瘤?等癌组织较正常组织相比,一的表达量都下调。 .经过生物信息学预测靶基因、、、、、 ,大部分参与细胞的问质.上皮转化【川。目前大部分学者认为滋养细胞浸 润异常是导致子痫前期发病的主要原因,『常妊娠血管中的细胞滋养细胞通常 能转换其黏附受体表现型,类似于细胞滋养细胞替换内皮细胞的过程,细胞滋 养细胞在侵入螺旋动脉逐步取代血管内皮细胞的过程中是否也存在类似于 的特殊转化机制本研究显示.在表达显著增加,推测在未来通过 下调.治疗重度子痫前期的同时可能会引发其他肿瘤的发生。 综上所述,本研究通过采用芯片筛选重度子痫前期患者胎盘中差 异表达的,初步勾勒出重度子痫前期患者胎盘中表达失衡的表 达谱,为重度子痫前期相关的功能研究及其靶基因研究提供宝贵的实验 数据。但由于芯片是高通量筛选,灵敏性和特异性有一定的局限性,需要进一 步应用荧光定量验证。因此,我们将进一步验证重度子痫前期患 者胎盘中 的差异,为子痫前期发病提供更可靠的科研依据。 第章结论 第章结论 、芯片能快速高通量筛选出重度子痫前期与正常妊娠胎盘组织 显著差异表达的谱,表明差异表达的可能参与了重度子痫前期 的发生和病理生理过程。 、相比于正常妊娠胎盘组织,重度子痫前期胎盘组织共有个 表达显著上调,目前尚无关于..、..、?一、 ..、..、?..等与重度子痫前期发病相关研究报 告,这些新发现的有望成为新的重度子痫前期早期预测和诊断的潜在 分子标记物,为预防和诊断重度子痫前期的发生提供科学依据。 致谢 致谢 首先衷心感谢我的恩师刘淮教授本研究课题是在刘淮老师的总体安排和 悉心关怀下完成,刘淮老师博大精深的学术造诣、严谨求学的治学态度、吃苦 耐劳的敬业精神、高尚的医德医风永远是我学习的榜样在此,向我尊敬的导 师致以最崇高的敬意和最诚挚的感谢 衷心感谢贺晓菊老师,本研究课题是在贺晓菊老师精心指导下完成论文的 选题、实验的设计到论文的写作,贺晓菊老师无私的科研精神及精湛的医学技 术让我留下了深刻的印象,真诚地感谢贺晓菊老师 衷心感谢江西省妇幼保健院中心实验室王枫主任、曾辛博士、邹阳博士、 刘发英老师等全体老师在实验研究中给予热情指导和无私帮助 衷心感谢江西省妇幼保健院产科郑九生主任、蔡庆华主任、王晨主任及科 教科习斌蓉老师、黄慧英老师等在科研中给予大量的支持和帮助 衷心感谢产科全体老师和手术室老师对我临床实践的指导和标本收集的热 心帮助 衷心感谢南昌大学医学院各位老师对我的学业的支持和帮助,感谢所有给 予我关爱和帮助的朋友和室友 衷心感谢我的父母给了我生命,感谢我的兄长一直以来给予我极大的关怀 和支持,他们永远是我前进的动力和源泉 最后衷心感谢为评阅本论文而付出宝贵时间和辛勤劳动的专家和教授们 黄齐香年月 参考文献 参考文献一. . ,, :;. .,:?. ,, . . ,:?.. : . ,,:?. .. ,,:. 曹泽毅.中华妇产科学.版一匕京:人民出版社,:. , , , . ,?. ,,:?. .: 】 , , ,.?. ,,:, . . . ,,:. 。 ... ,,:.: . , ,:?. ., , , .,:?. , , . 一 . 一., ,:?. .一 , . , ,:?.. , , . ,,:?. . , , ,.,,:?. ., , , :. ,, :?. , , , . 参考文献 : .? ,: . , , , .,,:?. . , , , . , .:?. . , , , ?. ,:?. ., ,】. 一. ,: ,, .? . . ,,:一 , , .一? . ,?. , : ., , ,.,,:. .: , , ..:., , , . .,, ,:. ., ,. ,,:?. .一 , ,. : ,:?..一, ,,】. ,,:. . , , , ’ .,, :?. . , , ,.参考文献 ,:一. . , , , ? . 】. , : 张弘,林其德,乔宠,等.子痫前期患者滋养细胞浸润相关基因及 蛋白表达的 研究】.中华妇产科杂志,,:.. 顾芸,李风山,王小青等.基质金属蛋白酶及其组织抑制物在胎 盘、血浆中的表达及 意义.中国妇幼保健,,:?. . , . ,,:一., ., : 一.,,:?. , , , . : .一 . , , :./ , , 『. ,:.. , , , . , :?. . , ’ .,:?. . , , ,: . ,:?. , , , .【. ,,?:?. . ,: , , . ,,: ... , , , : ? . ,,:?.. 一 】 五:。 ., ? . , : . 一彤 彤 . ,,:./ , , ,..一 . . 参考文献.:?. , ., , . . 】 . ,:. , ’ .,, :?. . 【】. ,,:?. .:.:.. .,, 金晓琴,子痫前期及正常妊娠胎盘组织中的表达.中国现代医 生,,: ..? .,,:.. , ,儿, .‘ ,,. ,,:?., , . ? . .: , , , . . . ,:? . ?. ,, :. , . , ,, :. , ., , . , :?. , . , , .. ,:?. . , , , . ., , :?. , . , , ? 】. , ,:?. , , , . .参考文献. . ,: , . , , , . ,,:?. 攻读学位期间的研究成果 攻读学位期间的研究成果 】黄齐香,刘淮,贺晓菊.及其在胎盘发育中的作用研究进展.南昌 大学医学院学报.已录用 贺晓菊,黄齐香,刘淮.重度子痫前期胎盘组织中的表达谱研究. 待发表. 综述 综述 及其在胎盘发育中的作用研究进展 摘要:存在于各种生物体中,在调控基因表达方面发挥着重要的 生物学作用,主要参与细胞增殖、细胞分化、凋亡、发育和逆境应答等多种生 理及病理过程。胎盘作为母.胎之间的一个交换器官,对胎儿的生长发育有重要 的作用。在胎盘中广泛并特异性地表达,能维持胎盘功能,以便适应胎 盘发生的各种病理变化,从而保障胚胎的正常发育。在此就胎盘中的表 达及最新研究进展做一简短综述。 关键词:;胎盘;子痫前期;生物学标记 是一类大小约的内源非编码小分子,广泛存在于动物、 植物、病毒等多种有机体中,是基因表达的重要调控因子。胎盘是母体和胎儿 进行物质交换的重要场所,具有气体交换、废物排泄、内分泌功能,在胎儿生 长发育中起着重要的作用。但胎盘生长发育及其功能潜在的分子调节机制仍未 阐明。最新研究发现一些在小鼠和人的胎盘中存在高表达,且部分 在胎盘中特异性表达,暗示其在胎盘中起着潜在的调节作用【 但 在胎盘中的生物学功能仍不清楚。本文将回顾与胎盘相关的,以 便能更加深入地了解其在妊娠生理及病理状态下的变化。 、 的生物形成 的生物形成和机制的研究仍处于起步阶段。首次发现于秀丽 隐杆线虫基因组,至今已有上千个人类的,具有物种问高度保守性、表 达时序性以及组织特异性的特点。大部分通过与靶的互补配对, 在转录后水平沉默基因的表达。每个可调控数百个基因的表达,而多个 也可协同调控一个靶基因,与靶基因形成了一种复杂的基因调控 网络。