打针用重组人促红素epo[精华]

打针用重组人促红素epo[精华] 注射用重组人促红素EPO(CHO细胞) 3检定 3.1原液检定 3.1.1蛋白质含量 用4g/L碳酸氢铵溶液 将供试品稀释至0.5-2mg/ml，作为供试品溶液。以4g/L碳酸氢铵溶液作为空白测定供试品溶液在320nm，325nm，330nm，335nm ,340nm，345nm和350nm的吸光度。用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数做直线回归，求得回归方程。照紫外-可见分光光度法(附录II A)，在波长276nm,280nm处，测定供试品溶液最大吸光度Amax，将Amax对应波长带入回归方程求得供试品溶液由于光散射产生的吸光度A光散射。按下式计算，应不低于0.5 mg/ml。 蛋白质含量(mg/ml)=(Amax-A光散射)?7.43×供试品稀释倍数×10 3.1.2生物学活性 3.1.2.1体内法 依法测定(附录? B)。 3.1.2.2体外法 按酶联免疫法试剂盒说明书测定。 3.1.3体内比活性 5每1mg蛋白质应不低于1.0×10IU。 3.1.4纯度 3.1.4.1电泳法 依法测定(附录? C)。用非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于10μg，经扫描仪扫描，纯度应不低于98.0%。 3.1.4.2高效液相色谱法 依法测定(附录? B)。亲水硅胶体积排阻色谱柱，排阻极限300kD，孔径24nm,粒度10μm，直径7.5mm,长30cm;流动相为3.2mmol/L磷酸氢二钠-1.5mmol/L磷酸二氢钾-400.4mmol/L氯化钠，pH7.3;上样量20,100μg，于波长280nm处检测，以人促红素色谱峰计算理论板数应不低于1500。按面积归一化法计算人促红素纯度，应不低于98.0%。 3.1.5分子量 依法测定(附录? C)。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝R250染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于1μg，分子质量应为36,45kD。 3.1.6紫外光谱扫描 依法测定(附录? A)，用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至0.5-2mg/ml,在光路1cm、波长230nm-360nm下进行扫描，其最大吸收峰279nm?2nm;最小吸收峰250nm?2nm;在320,360nm处无吸收峰。 3.1.7等电聚焦 取尿素9g、30%丙烯酰胺单体溶液6.0ml、40% pH 3-5的两性电解质溶液1.05ml、40% pH 3-10的两性电解质溶液0.45 ml、水13.5ml，充分混匀后，加入N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺 15μl和10%过硫酸铵溶液0.3ml，脱气后制成凝胶，加供试品溶液20μ(浓度应在每l1 ml含0.5 mg以上)，照等电聚焦电泳法进行(附录? D)，同时做对照。电泳图谱应与对照品一致。 3.1.8唾液酸含量 每1mol人促红素应不低于10.0mol (附录? C)。 3.1.9外源性DNA残留量 每10000IU人促红素应不高于100pg(附录? B)。 3.1.10 CHO细胞蛋白残留量 用双抗体夹心酶联免疫法检测，应不高于蛋白质总量的0.05%。 3.1.11细菌内毒素检查 每10000IU人促红素应小于2EU(附录 ? E凝胶限量试验)。 3.1.12牛血清白蛋白残留量 依法测定(附录? 1)，应不高于0.01%。 3.1.13肽图(至少每年测定1次) 供试品经透析、冻干后, 用1%碳酸氢铵溶液溶解并稀释至1.5mg/ml，依法测定(附录? E)，其中加入胰蛋白酶(序列分析纯)，37??0.5?保温6小时，色谱柱为反相C柱(25cm×4.6mm，粒度5μm，孔径30nm) ，柱温为45??0.5?;流8 速为0.75ml/分钟;进样量为20μl;按下进行梯度洗脱(表中A为0.1%三氟乙酸水溶液，B为0.1%三氟乙酸-80%乙腈水溶液)。 编号 时间/分钟 流速/ml A% B% 1 0. 00 0.75 100.0 0.0 2 30.00 0.75 85.0 15.0 3 75.00 0.75 65.0 35.0 4 115.00 0.75 15.0 85.0 5 120.00 0.75 0.0 100.0 6 125.00 0.75 100.0 0.0 7 145.00 0.75 100.0 0.0 肽图应与人促红素对照品一致。 3.1.14 N-末端氨基酸序列(至少每年测定1次) 用氨基酸序列分析仪测定。N-末端序列应为: Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr。 3.2半成品检定 3.2.1细菌内毒素检查 依法测定,每1000IU人促红素应小于2EU(附录? E凝胶限量试验)。 3.2.2无菌检查 依法检查(附录? A)，应符合。 3.3成品检定 除复溶时间、水分测定、和装量差异检查外，应按标示量加入灭菌注射用水， 复溶后进行其余各项检定。 3.3.1鉴别试验 按免疫印迹法(附录? A)或免疫斑点法(附录? B)测定，应为阳性。 3.3.2物理检查 3.3.2.1外观与复溶时间 应为白色疏松体，复溶后应为无色澄明液体，加入标示量的灭菌注射用水，复 溶时间应该不超过两分钟。 3.3.2.2可见异物 依法检查(附录? B)，应符合规定。 3.3.2.3装量 依法检查(附录? A)，应符合规定。 3.3.3化学检定 3.3.3.1 pH值 依法测定(附录V A)，应符合批准的要求。 3.3.3.2钠离子含量 应不大于190mmol/L(附录? J)。 3.3.3.3水分 应不高于3.0%(附录? D)。 3.3.3.4人血白蛋白质含量 依法测定(附录? B第二法)，应符合经批准的蛋白质含量范围。 3.3.3.5 渗透压摩尔浓度 依法测定(附录V H)，应符合批准的要求。. 3.3.4生物学活性 3.3.4.1体外法 按酶联免疫法试剂盒说明书测定，应为标示量的80%,120%。 3.3.4.2体内法 依法检查(附录? B)应为标示量的80%,140%。 3.3.5无菌检查 依法检查(附录? A)，应符合规定。 3.3.6细菌内毒素检查 每1000IU人促红素应小于2EU; 5000IU/支以上规格的人促红素，每支应小于 10EU(附录? E凝胶限量试验)。 3.3.7异常毒性检查 依法检查(附录? F小鼠试验法)，应符合规定。