[最新精品]大鼠孤束核葡萄糖敏感神经元、胰岛素敏感神经元对耳甲电针的反应

[最新精品]大鼠孤束核葡萄糖敏感神经元、胰岛素敏感神经元对耳甲电针的反应 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ 大鼠孤束核葡萄糖敏感神经元、胰岛素敏感神经元对耳甲电针的反应 大鼠孤束核葡萄糖敏感神经元、胰岛素敏感神经元对耳甲电针的反应 [摘要]目的:初步探讨耳针降糖作用的中枢机制。方法:微电极胞外孤束核(NTS)神经元活动，将记录的细胞随机分为颈静脉注射葡萄糖组、胰岛素组及耳甲电针组，观察上述处理因素对各组神经元放电活动的影响。结果:NTS存在葡萄糖敏感和胰岛素敏感神经元，葡萄糖敏感神经元中抑制型占37.3,，兴奋型占10.9,胰岛素敏感神经元中兴奋型占33.3,，抑制型占4.9,，电针耳甲，NTS神经元有49.3,(34,69)放电频率增加，4.3,(3,69)放电频率减少，34个耳针激活细胞中有18个对葡萄糖呈抑制反应，8个对胰岛素呈兴奋反应。结论:耳甲电针能兴奋NTS葡萄糖敏感神经元(抑制反应型为主)和胰岛素敏感神经元(激活反应型为主)，耳针的降糖效应可能与调节上述神经元放电活动有关。 [主题词]耳针;电针;孤束核,针灸效应，神经元,针灸效应;葡萄糖,针灸效应I@葡萄糖敏感神经元;@胰岛素敏感神经元 有显示，耳针具有较好地降低糖尿病患者血糖水平的作用，但其机制目前尚不清楚。血糖的正常水平维持受到胰岛素浓度的调节，而支配胰岛的迷走神经兴奋能够促进胰岛素的分泌。孤束核(NTS)是内脏感觉传人的重要中继站，接受来自内脏如胃肠、肝门以及胰岛等组织的迷走神经传人，通过汇聚整合再把与摄食相关的信号传入到前脑，如下丘脑外侧区等中枢核团，从而共同调节摄食行为，控制血糖。体外细胞研究显示大脑中枢除了下丘脑外还有其他核团存在葡萄糖敏感神经元，其中包括最后区(AP)、NTS以及迷走神经运动背核(DMV)E6n。胞外单细胞放电记录实验明NTS尾部存在着较大比率(70,以上)的血糖敏感神经元，其中大部分神经元对葡萄糖浓度升高表现出放电频率增加，NTS的这些葡萄糖敏感神经元很可能参与了体内能量代谢和血糖调节;另一方面，有资料显示NTS还存在一些神经 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ 元对胰岛素水平敏感。研究表明NTS与耳甲部有神经纤维联系。笔者猜测针刺耳甲的信号很可能通过神经传人到达NTS，激活了上述NTS处血糖和胰岛素敏感神经元，通过耳一迷走一胰岛素(葡萄糖)完成体表与内脏的相关反射活动，维持正常血糖水平稳定。NTS是副交感神经初级传人神经元在中枢内集中投射的核团，是参与内脏一躯体反射的重要初级整合中枢，其是否还存在着葡萄糖、胰岛素敏感神经元?NTS处葡萄糖、胰岛素敏感神经元是否对电针刺激耳甲起反应?本实验旨在采用细胞外记录技术观察NTS的葡萄糖敏感神经元和胰岛素敏感神经元的活性特征，观察耳甲电针对NTS葡萄糖和(或)胰岛素敏感神经元放电活动的影响，初步探讨耳针降糖效应的中枢机制。 1 与方法 1.1 实验动物及分组 健康成年的Sprague-Dawley雄性大鼠31只，清洁级，体重200,220 g，中国医学科学院实验动物研究所提供(合格证号:A06―055)。将探查到的NTS神经元随机分为葡萄糖输注组、胰岛素输注组以及耳甲电针组，每组神经元各140个，耳针刺激的部位为大鼠耳甲艇、耳甲腔内面相当于人耳穴的“肾”“胰腺”“肝胆”等穴点。耳针电极为一对自制银质圆形耳豆，形似王不留行籽，直径约2 mm。 1.2 实验步骤 (1)细胞外记录神经元放电手术过程 手术实验前配制15,葡萄糖、6 IU,mL胰岛素及生理盐水(o.9,)，0.5 tool,L醋酸钠溶液，2,滂胺天蓝溶液。用10,的氨基甲酸乙酯(乌拉坦)腹腔注射麻醉(1.O,1.2 g,kg)，手术及实验过程动物体温控制在(37+1)?。大鼠麻醉后，动物俯卧，将大鼠头部用耳棒固定于立体定位仪头部固定器上，下齿挂在鼠头夹中，口鼻部用鼠头夹压紧。头顶部正中矢状线切口，暴露前后囟并调至同一水平。根据Paxinos和Watson的大鼠脑立体定位图谱，于NTS(距前囟:-11.3,-14.3 mm;中线旁开:O,2.3 mm;深度:4,7 ram)的颅骨 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ 表面，用牙科钻开颅，在显微镜下分层剥离硬脑膜和软脑膜，暴露脑组织并用温的石蜡油覆盖;同时对动物施行颈静脉插管手术，插管朝向头端，外接四通管，四通管连接自动推进微量注射器，分别注入事先配制的葡萄糖溶液、胰岛素溶液以及生理盐水。将手术后的大鼠头部用固定器固定在大鼠立体定位仪上，以玻璃微电极胞外记录NTS神经元对不同施加因素的放电频率变化情况，电极内充有2,滂胺天蓝溶液(电阻为10,20 MQ)。 (2)施加不同处理因素 手术完成后，通过微电极操作控制器，于孤束核内上下探查神经元放电信号。当探查到孤束核细胞放电信号后，将细胞随机分为3组，分别按如下操作顺序施加因素:第1组，颈静脉输注葡萄糖(输注速度为O.25 mL,s)，观察孤束核细胞放电频率的变化，鉴别葡萄糖反应神经元的类型(放电频率升高、降低、不变)，如细胞放电频率发生变化，则待细胞恢复稳定放电频率状态，关闭四通管葡萄糖端，打开生理盐水端开关，输注生理盐水(输注速度同前)，继续观察细胞放电频率变化，如果所记录的神经元对生理盐水未发生放电频率变化(排除血压变化影响)，则认为是实验目标神经元，否则放弃统计(下同)。第2组，颈静脉输注胰岛素(输注速度同前)，观察孤束核细胞放电频率的变化，鉴别胰岛素反应神经元的类型(放电频率升高、降低、不变)，如细胞放电频率发生变化，则测试其对生理盐水是否发生放电频率变化，操作同前。若细胞放电活动对胰岛素输注敏感，则继续观察其对葡萄糖输注(浓度与推注速度同前)的放电频率变化情况。第3组，耳甲区穴位电针刺激(强度:2 mA，间隔:O.4 s，持续时间:O.4 ms)，每次刺激时段为30 s，自制耳豆电极连接于刺激器的正负两极，分别用胶布粘贴于耳甲部相邻的两穴(“肾”“胰腺”“肝胆”等)表皮，观察NTS神经元放电活动频率变化情况，若细胞放电频率发生明显变化，待细胞放电活动稳定后进一步分别监测输注葡萄糖及胰岛素对该细胞放电活动的影响，如果细胞放电活动发生反应，则待细胞放电活动稳定后继续输注生理盐水作对照。 上述实验过程中，连续2个被测神经元间隔时间为20,40 min。细胞放电活动变化鉴别标准为:放电频率比施加因素前的基础放电频 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ 率(或稳定状态放电频率)升高或者降低30,以上，则认为神经元发生激活反应(活动兴奋)或神经元发生抑制反应(活动抑制)，否则定为放电频率无变化(活动无反应)。 (3)细胞记录部位的组织学定位 实验结束后，玻璃微电极通以10A的阴极电流20,30 min，泳出滂胺天蓝标记电极尖端位置，随后处死动物，取出含记录部位的大脑组织，用10,福尔马林溶液固定，3天后冰冻切片，染色，显微镜下观察，记录电极尖端所在位置，凡偏离NTS的结果舍弃不用。 1.3 数据采集及分析 Power Lab计算机数据采集系统及Chart 5.0分析软件进行数据分析。各组实验数据以刺激前、刺激后、差值(刺激前一刺激后)及百分比(差值,刺激前)做描述性统计，数据表示为均值?标准差。 2 结果 2.1 NTS葡萄糖敏感神经元的分布情况 正常大鼠颈静脉注射葡萄糖，完整记录110个NTS细胞放电(其余细胞未记录完整，不做统计，下同)，其中:57个细胞(51.8,)放电频率无变化;41个细胞(37.3,)放电频率减少，呈抑制反应，放电频率的降低率为(60.36?15.10),;12个细胞(10.9,)放电频率增加，呈兴奋反应，放电频率的增加率为(56.78-t-9.24),。 2.2 NTS胰岛素敏感神经元分布情况及其对葡萄糖的反应 颈静脉注射胰岛素，完整记录81个NTS细胞放电，据统计50个细胞(61.7,)放电频率无变化;27个细胞(33.3,)放电频率增加，上升率为(47.34+11.24),;4个细胞(4.9,)放电频率减少，下降率为(43.24+12.11),。其中27个兴奋反应细胞中有18个细胞对葡萄糖有抑制反应，9个细胞对葡萄糖无反应;4个抑制反应细胞中有2个对葡萄糖有兴奋反应，2个对葡萄糖无反应。 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ 2.3 耳甲电针对NTS葡萄糖敏感神经元和胰岛素敏感神经元放电活动的影响 电针大鼠耳甲区穴位，完整记录69个NTS细胞放电，其中32个细胞(46.4,)放电频率无变化，34个细胞(49.3,)放电频率增加，增加率为(54.79?24.21),;3个细胞(4.3,)放电频率减少，减少率为(44.655=9.13),。其中34个兴奋反应细胞中有18个对葡萄糖有抑制反应，14个对葡萄糖无反应，2个对葡萄糖有兴奋反应;同样这34个对耳针起兴奋反应细胞中有8个对胰岛素有兴奋反应，3个对胰岛素起抑制反应，23个对胰岛素无反应。 电针耳甲细胞兴奋反应的潜伏期为(3?1)s，细胞抑制反应的潜伏期为(5?2)s。耳针实验中，37个反应细胞中有21个细胞呈现3,5 min长时程的放电频率增加，其中有2个细胞由原来的静息状态突发成放电状态;3个抑制性反应细胞均呈长时程放电频率抑制。 实验结果统计见表1，NTS神经元对输注葡萄糖、胰岛素以及耳甲电针的典型活性反应见图1，电针耳甲过程中记录到的不同反应类型的NTS神经元分布情况见图2。 3 讨论 越来越多的实验表明耳甲刺激具有良好的治疗疾病作用，这些疾病包括糖尿病、癫痫、阿尔茨海默氏病和帕金森病等。如日本学者实验用300 ms、1.5 V、l Hz电针刺激自发糖尿病大鼠的耳甲迷走神经支配区域，刺激时间10 min，对照组为耳郭非迷走神经支配区域，结果发现电针刺激对糖尿病胰岛素抵抗急性效果良好，电针耳迷走神经支配区可见葡萄糖输注率(GIR)显著减少。有人观察发现耳穴刺激能明显缓解实验诱导的癫痫发作。德国学者最近实验通过刺激人外耳道迷走神经分支，记录到迷走感觉诱发电位(vagus sensory e,voked potential，VSEP)，根据其远场电位的测量推测其源自脑干的迷走神 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ 经核，他们的实验观察到耳郭不同部位刺激记录到的VSEP不同，刺激耳迷走神经分布的耳甲部靠近耳屏内处，VSEP变化最明显。耳甲刺激治疗上述疾病的机制如何，根据推测认为可能与耳甲刺激激活了与之相联系的初级中枢相关神经元有关。这些神经元可能介导了耳针刺激信号，经初步整合后上传至下丘脑或更高一级脑干，再经内脏迷走共同通道下传至各内脏器官，进而发挥其治疗效应。 众所周知，葡萄糖在调控机体能量代谢内稳态中起着重要作用，血糖代谢紊乱而产生了一系列的并发症是糖尿病人生存质量下降的主要原因。目前已知血糖受到了大脑中枢多个核团的调控。20世纪70年代以来，有学者研究发现在下丘脑的外侧核(LHA)大约有1,3的神经元是葡萄糖敏感神经元(glucose-sensitive neurons，GS)，这些神经元可以介导因血糖的降低而启动的摄食行为，因此，此区被称之为摄食中枢(feeding center);而在下丘脑的腹内侧核(VMH)则存在另一类葡萄糖敏感神经元:葡萄糖受体(glucoreceptor，GR)神经元，葡萄糖浓度增加可以使这类细胞的活性增加，这类神经元可以介导因血糖浓度升高而终止摄食行为，此区被称之为饱中枢(satiety center)。研究结果显示，上述2种葡萄糖敏感神经元除了对葡萄糖浓度敏感外，对胰岛素也有活性反应，单独胰岛素能轻微地抑制VMH的GR神经元活性，而增加LHA的GS神经元活性，且活性增加呈剂量依赖性。 由此可见，上述2类神经元很可能对血糖浓度和血胰岛素浓度的监测和调节起重要作用，并且可能与耳针降低糖尿病患者血糖水平有关。笔者实验发现，NTS中也分布着前述2类神经元，这与Mi,zuno Y等的实验结果相似。而且实验显示，较之丘脑，NTS有更大分布比例的葡萄糖敏感神经元，据统计，葡萄糖敏感神经元占48.2,(53,110)，其中可以判断为GS的神经元占37.3,(41,110)，可以判断为GR的神经元占10.9,(12,110)。根据上述实验结果笔者推测NTS的这些葡萄糖敏感神经元可能对维持血糖在相对恒定水平也起着非常重要的作用，而在电针耳甲实验中笔者发现有49.3,NTS神经元(34,69)放电频率升高，在34个神经元中有18个对葡萄糖有抑制反应，由此可推测耳针作用很可能与激活了NTS处的葡萄糖敏感神经元 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ 有关，且以对葡萄糖抑制反应的神经元为主。 另一方面，经典生理学认为胰岛素的分泌受到交感神经、副交感神经以及肠胰轴的神经支配，支配胰岛的迷走神经纤维在中枢的神经元主要分布在迷走神经背核(DMV)和疑核(NA)以及下丘脑的VMH和LHATM支配胰岛的交感神经在中枢的神经元主要分布在节前脊髓神经元(SPN)和下丘脑室旁核(PVN)。而对于NTS是否存在与胰岛素水平相关的神经元，目前报道尚少。Bubs等近期报道在NTS处记录到有与胰岛组织的迷走神经纤维联系的神经元，研究者用伪狂犬病毒跨神经节示踪法观察支配胰腺组织的中枢神经元分布情况。当切断双侧交感神经时，记录到的病毒感染的神经元在孤束核有相当数量的分布;当切断双侧迷走神经时，记录的病毒感染的大脑中枢不同核团神经元在孤束核也有少量分布。作者根据实验结果认为大脑中枢的各核团都或多或少地存在不同级别的神经元参与调控胰岛组织的分泌功能，其中孤束核分布有较多的二级和三级神经元参与迷走神经支配胰岛，同时也存在着少量的三级神经元参与交感神经调控胰腺组织的功能;并且他们认为，经典生理学所谓的交感神经中枢和副交感神经中枢之间实际 上存在着密切的联系，参与调控胰腺的副交感和交感神经之间也存在着相互制约、互相影响。因此笔者推测耳针的效应很可能是因为一方面兴奋了副交感神经，同时另一方面又抑制了交感神经的缘故。 笔者实验过程中发现在NTS中大约有33.3,的神经元对胰岛素有兴奋作用，并且在这27个胰岛素兴奋的神经元中有18个对葡萄糖有抑制反应，这和Oomura等报道胰岛素能够增加LHA处Gs神经元的活性结果相似，与之不同的是，本实验是在NTS处观察到这些胰岛素葡萄糖敏感神经元。这一结果与Piero等的实验结果不大相符，Piero报道向孤束核微量注射20 nL的胰岛素能抑制神经元的放电频率，抑制反应细胞占总记录细胞的73.1,(38,52)，而其余14个神经元则全部对胰岛素无反应，而笔者实验中记录到有33.3,的神经元对静脉输入胰岛素有兴奋反应，结果与之不符，这可能与记录电极位置不同、所记录的细胞类型有别有关。Piero记录到的是对血压敏感的神经元，主要与心血管压力反射相联系的交感神经兴奋有关，并且其所 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ 记录的神经元对葡萄糖也没有反应。根据Buns等[25]的实验结果，笔者推测本实验记录的这些神经元很可能与来自胰腺等内脏组织传入的迷走神经纤维有联系，并且参与了血胰岛素和血糖的调控。笔者电针耳甲实验结果显示，对电针起兴奋反应的34个细胞中有8个对胰岛素有兴奋反应，3个起抑制反应，其他23个细胞对胰岛素无反应，说明电针刺激耳甲区，刺激信号很可能也通过迷走神经耳支传递给NTS处胰岛素敏感神经元(主要是对胰岛素起兴奋性反应的神经元)，进而调节外周胰岛素水平。从细胞记录的位置来看，葡萄糖敏感神经元主要分布于孤束核尾侧部，在此区内有内脏迷走传人，并且与迷走运动背核和最后区相联系。笔者另外一项形态学研究结果已经耳甲区迷走神经耳支与孤束核存在直接的纤维联系(实验结果即将发表)。 解剖实验发现NTS和DMV附近缺乏血脑屏障，血液中的葡萄糖和胰岛素能够直接到达NTS处的细胞外液，NTS葡萄糖和胰岛素敏感神经元可能直接(或者通过局部环路)感应细胞外液的葡萄糖和胰岛素的浓度变化，从而引起细胞的放电活动变化。本实验耳针引起的细胞反应的潜伏期较短，这有可能是由于耳针直接刺激了由NTS发出的迷走神经耳支，进而干预了NTS的葡萄糖敏感神经元或(和)胰岛素敏感神经元放电活动的结果，这种耳一迷走反射过程可能是耳针降糖效应的直接原因。