扇头蜱分子生物学论文

扇头蜱分子生物学论文 扇头蜱分子生物学论文预读: 摘要:1材料与方法 1.1采集地点的选择伊宁县位于东经80?13′,82?42′,北纬43?35′,44?29′之间,东邻尼勒克县,西与伊宁市和霍城县接壤,南邻伊犁河,与察布查尔、巩留两县隔河相望.同时,位于伊犁河谷中部,水草丰富,境内的伊宁口岸是伊犁地区重要的贸易口岸. 1.2实验材料 1.2.1蜱的来源2013年4,5月,从伊宁县的2个采集点、2个绵羊群,每群,30只,均未药浴,采集其体表寄生蜱,共获得硬蜱324只,放置于潮湿阴暗处,以保持其存活. 1.2.2主要试剂PCR所用试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司;DNA提取试剂盒(DNeasyBloodTissueKit)购自德国Qiagen公司;其他试剂均为分析纯. 1.3实验方法 1.3.1蜱种鉴定参照《中国经济昆虫志》,9,,用普通解剖显微镜将324只蜱进行形态学鉴定,初步分类后,从中选取50只用配备数码照相功能的解剖显微镜(LEICAM165C)拍摄图片,对蜱的盾板、假头、假头基、肛侧板、气门板、第一缘垛、孔区(雌蜱)等形态进行对比观察并测量,11,.1.3.2蜱的处理和DNA提取将蜱标本分别依次用浓度为70%、50%、30%、10%的乙醇溶液于37?摇床中振荡冲洗1h,再用超纯水反复冲洗,干燥.最后置于消毒灭菌的1.5mlEP管中.按照DNA提取试剂盒使用说明书提取虫体基因组DNA,置-20?保存备用. 1.3.3基因扩增用上游引物5′-CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG-3′,下游引物5′-CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT-3′扩增线粒体16SrRNA序列,12,;上游引物5′-CAAAAWCCTGGTAAAATTAAA-3′和下游引物5′-GCACTATCAAGCAACACGACT-3′扩 序列,10,.25μlPCR反应体系:模板1.5μl(约50ng),上游和下游引物各0.7 增CO? 5μl(75pmol),50mmol/LKCl,10mmol/LTris⁃HCl(pH8.3),1.5mmol/LMgCl2,1单位TaqDNA聚合酶.PCR反应循环参数为:?16SrRNA为94?预变性5min,92?变性30s,54?退火30s,72?延伸30s,共38个循环,72?终延伸8min.?CO?为94?预变性5min,92?变性30s,50?退火30s,72?延伸60s,共38个循环,72?终延伸8min.扩增片段后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序.1.3.4序列分析及系统进化树构建结合GenBank登录的图兰扇头蜱的16SrRNA和CO?参考序列,将本实验PCR扩增的6条16SrRNA及6条CO?序列测序结果与参考序列比对,运用Mega5.0软件的ClustalX程序分析,计算遗传距离并构建遗传进化树. 2结果 2.1蜱种鉴定所鉴定蜱共324只(168?、156?),虫体体型较小,雌虫体长3.2,5.5mm,雄虫体长2.9,3.6mm,呈褐色,背腹扁平似卵圆形,芝麻至米粒大,雌蜱饱血后可膨胀达蓖麻籽大.体分为假头和躯体两个主要部分(图1A).假头基呈六角形,侧角明显,后缘微凹(图1B).雄蜱盾板覆盖整个背部,雌蜱盾板覆盖背前部,前部较窄,后部圆钝,盾板遍布刻点,以细刻点居多,粗刻点少而零散(图1C).眼卵圆,靠近盾板前部边缘.须肢粗短,中部最宽,前端稍窄.雄蜱气门板长卵形(图1D).体端有缘垛,中垛大于边垛,常有尾突(图1E).有肛沟,雄性肛侧板后缘内斜明显,内缘具角突,长约为宽的2.5,3.0倍,内缘中部稍凹,后缘向内显著倾斜,其后方凸角明显(图1F).结合有关文献,9,13,认为伊宁县的蜱具有硬蜱科扇头蜱属图兰扇头蜱的特征.但由于吸血、饱血雌蜱及部分未成熟或形态变异的雄蜱,仅用传统形态学分类方法不能准确区分.因此,从324只中选出6只雌雄分别具有形态差异的蜱(4?、2?),根据采集地点分别将其命名为YN-1、YN-2、YN-3、YN-4、YN-5和YN-6.YN-1为当地典型雄性图兰扇头蜱;YN-2和YN-3为半饱血雌蜱,因其腹部吸血膨胀已无法观察缘垛,肛侧板和副肛侧板难以区分形态且边界不清;YN-4、YN-5和YN-6为部分形态特征改变雄蜱,YN4和YN5体端较宽似倒置三角形与典型的图兰扇头蜱卵圆形体端不同,且YN5气门板呈长逗点形与血红扇头蜱气门板相似;YN6肛侧板后缘圆钝,凸角不明显.因此对这6只蜱采用分子生物学方法进一步分 析,对上述形态学鉴定结果进一步验证. 2.2分子生物学鉴定 2.2.1PCR扩增通过PCR扩增上述形态学差异较大的6只图兰扇头蜱线粒体DNA,产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,均获得特异性很好的PCR产物,与预期目的片段一致(16SrRNA约为460bp,CO?约为760bp). 2.2.2图兰扇头蜱16SrRNA和CO?基因片段组成利用Mega5.0软件计算6只图兰扇头蜱 基因片段碱基组成.16SrRNA基因片段A、T、C、G的平均碱基含量分的16SrRNA和CO? 别为36.68%、37.12%、10.7%和15.5%,碱基A，T平均含量是73.78%.CO?基因片段A、T、C、G的平均碱基含量分别为38.56%、31.78%、14.12%和15.54%,碱基A，T平均含量是70.34%. 2.2.3图兰扇头蜱基因序列比对及系统进化树运用Mega5.0软件的ClustalX程序进行多重序列比对后,16SrRNA获得2种不同序列,并登录GenBank,登录号分别为KF547987和KF547989;CO?获得3种不同序列,登录号分别为KF688136、KF688137和KF688138.各结合GenBank登录的3种扇头蜱的参考序列构建系统进化树.6只图兰扇头蜱16SrRNA基因片段的遗传变异很小,共检测出2个单倍型,1个变异位点.其中YN-2、YN-3、YN-4和YN-5序列相同,为一种单倍型;YN-1、YN-6在216位点处为转换位点(T-C),为一种单倍型.基因序列比较结果显示同源性均在99.5%以上,遗传距离为0.3%,0.5%.而上述6只图兰扇头蜱的CO?基因片段序列变异较大,共检测出3个单倍型,4个变异位点.YN-1、YN-2和YN-6序列相同,为一种单倍型;YN-3和YN-5检测到3个变异位点,均为转换位点(A-G),无插入/缺失和颠换现象;YN-4在上述变异基础上,于574位点处发生转换(A-G).基因序列比较结果显示同源性均在98.6%以上,遗传距离为0.3%,1.9%. 3讨论 调查结果表明新疆伊宁县绵羊体表普遍寄生了图兰扇头蜱,据以往报道图兰扇头蜱主要分布于新疆的巴楚、喀什、霍城、和田、哈密、呼图壁、库尔勒、轮台、阿瓦提、沙雅、于田等荒漠草原和荒漠地区,14,.而伊宁县地处亚欧大陆腹地,伊犁河谷中部,属中温带干旱型内陆山地气候,该地区气候温和,水源充沛,水草丰茂,以往并不适合图兰扇头蜱的生存繁殖,而此次在伊宁县发现图兰扇头蜱分布普遍,可能与新疆北疆近30年雨水过少、特殊的植被分布及气候改变有关.线粒体基因已成为群体遗传学和进化生物学研究中的重要分子标记.Murrell等,15,认为线粒体基因对于分子进化的研究具有很大价值,且更适于种内遗传差异的分析.目前蜱类研究中用的最多的线粒体基因为12SrRNA、16SrRNA、CO?和CO?等基因,10,.线粒体上的不同基因具有不同的解析功能,同一基因在不同的物种间也具有不同的解析能力.并且,在系统发育研究中多个数据比单个数据的效果要好,16SrRNA基因序列由于其保守性和存在的普遍性,被大量用于蜱类的物种鉴定和系统研究,12,16-17,.CO?基因是线粒体呼吸链末端的一个催化酶,比其他基因在生化功能的研究上更完备,普遍存在于真核生物和原核物细胞的线粒体中;此外,CO?基因是核基因组以外独立的线粒体环状DNA,所以能够用来比较其在生物进化上的相互关系,18,.吕继洲等,19,通过16SrRNA和CO?基因鉴定小亚璃眼蜱(H.anatolicum)、亚洲璃眼蜱(H.asiaticum)和残缘璃眼蜱(H.detritum)3种形态上极其相近的蜱种.一般来说,在变异程度上16SrRNA基因较CO?基因明显保守,20,,本实验研究结果也证实了这一观点.并且,通过对2个基因的研究发现,该地区图兰扇头蜱种内遗传差异显著,证实图兰扇头蜱具有生物多样性.由于蜱传播病原体一般与蜱种之间存在着一定的对应关系,亲缘关系越近的蜱种,其传播相同病原体的机会越大,21,.因此,不同蜱种的种内遗传差异与蜱传疾病的变化仍需进一步研究,为蜱媒病的预防控制提供依据. 作者:杜景云 牟路萌 张璘 王丽娜 王安东 张科 陈创夫 王远志 单位:新疆石河子大学生物医学院 山东省济南市中心医院 新疆石河子大学 动物科技学院 河南省平顶山学院新农 村发展研究院 扇头蜱分子生物学论文责任编辑:杨雪: