DNA电泳条带为什么有时候跑不开呢

DNA电泳条带为什么有时候跑不开呢 最近准备插4个片段进luciferaes表达载体，却在准备切条带的时候又发生了这种情况，以前也出现过一次，为什么第一个条带是连在一起的呢，是不是因为模版加多了，因为我前一次做条带明显没旁边3个亮，比较淡，所以我用了上次的PCR产物做了模版。 另外我用了天根的胶回收试剂盒，回收的DNA量非常的少最多的一个才9ng/?l左右，我加了50ul的洗脱液。这个到底是出了什么问题呢,我回收的是下面那3条跑开的条带，大小是500Bp左右，下面小的Marker都跑没了，不知道是为什么，以前都有的，胶是1.2%的浓度,电压120V,时间是25分钟。 建议用原模板进行PCR，如果担心PCR量较少，可同时扩增几管(最后回收成1管)，如果PCR产物较纯(无非特异性杂带)，则可以直接采用纯化，相对于胶回收，可以减少损失。如果PCR产物可能存在突变，混在一起后会比较麻烦，你可以就一管回收下来，先连T克隆，在进行后续载体的构建。PS:做T克隆时，回收产物只要有就够了，不需要太多的回收产物，即使你回收后的产物电泳检测都看不到都没关系，T克隆很容易的。 关于胶回收问题，我不知道你的片段大概多少，用的什么公司的回收试剂盒。一般胶回收时， 你的片段若小于500bp，则在溶胶后，需要加异丙醇(按0.1g 胶加100ul的比率)，混匀后， 上柱。这一步在华舜的胶回收试剂盒里面是有的，而在promega以及omega的一些试剂盒 里面是没有的。胶回收效率一般能够达到60%左右，而直接纯化的话回收效率都在80%以 上，如果你想要产物浓度高，若没有杂带的话，是可以采用纯化的。 For SOE-PCR: 1, never use the SOE-PCR product as the 2ndary PCR template, since it usually contains several different length products which will cause your final products as a smear. 2, use about 1/10 conc. of middle primers to increase the PCR products: for example of your case: you should have 3 pairs of PCR primers to amplify the first group products (those three bands on the right side), let's name those primers as 1 to 6. 1 and 2 for the 2nd band 3 and 4 for the 3rd band 5 and 6 for the 4th band in this case, odd number primers are forward primers, and even number primers are reverse primers. And let's say you want to PCR them together as the order of 5'-2nd band-3rd band-4th band-3'. When you perform SOE-PCR, in addition of your regular primer 1 and 6 as the pair, add 1/10 the conc. 3 and 4 with it. 3, Run 2% gel, which will increase the resolution of DNA band (<800bps) 4, To increase the PCR purification yield, add 1/10 volume of isopropenol before load on the column is one; the other one is use 50oC H2O to elute the DNA; also after add the elution buffer (50oC H2O), wait 1-5 min before centrifuge. BTW, 9ng/ul is not too low if considering the DNA size.