IL_10对感染口蹄疫病毒的树突状细胞的影响

IL_10对感染口蹄疫病毒的树突状细胞的影响 IL210 对感染口蹄疫病毒的树突状细胞的影响 郎需龙 ,王兴龙 ,孙春辉 ,张付贤 ,卜昭阳 ,路浩 ,唐婕 ,党源 ,王英超 () 军事医学科学院军事兽医研究所 , 长春 130062 ( ) 摘要 :树突状细胞 dendritic cell s ,DC是机体中重要的抗原递呈细胞 ,在病毒感染机体后的免疫调节过程中具有重要作 用 。为研究调节 IL210 的分泌是否会影响 DC 感染病毒后的免疫反应 ,本研究用 FMDV 感染 DC 后发现 , IL210 的分泌量可以 影响 DC 在免疫过程中各种细胞因子的表达 ,故认为 IL210 在口蹄疫病毒感染过程中对机体的免疫调节具有重要的影响 。 关键词 : IL210 ;口蹄疫病毒 ;树突状细胞 + () 文章编号 :167127236 20091120027203 中图分类号 : S852 . 65 9 . 6 文献标识码 : A ( ) ,从而研究 DC 感染 FMDV 后 , IL210 对各种 节作用 树突状 细胞 de ndritic cell s , DC是 机体 中 重 要的抗原递呈细胞 ,当其受到病毒或其他影响因子 细胞因子表达水平的影响 。 刺激时 ,未成熟树突状细胞发育为成熟的 DC 后 ,吞 1 材料与方法 r m GM2CSF 、r m IL24 、r m IL210 1 . 1 主 要 试 剂 噬能力及增殖能力下降 ,但具有很强的移动能力和 () ( ) Bio vi sio n 公司, IL210 抗体 A bca m 公司,细菌脂 抗原递呈能力 。由于 IL210 对 DC 活 化 成熟 、分 泌 () ( 细胞因子 、抗原加工 递呈 等 都有 影响 , 因 而影 响 了 多糖 L PS , Si gma 公司, R PM I21640 培养液 Gi b2 ) ( ) ( ) co 公司, Trizol Rea ge nt Invit ro ge n 公司,荧光定 DC 的激发与免疫应答 Su ng ,2008。IL210 可通过 TM 影响树突状细胞生物学活性的 发挥 起免 疫调 节 作 量 PCR 检测试剂盒 S YB R Pri me Scrip t R T2PCR ( ) 用 ,且 IL210 可抑制树突状细 胞 的成 熟及 IL212 的 Kit Ta Ka Ra 公司, 细胞 因子 EL ISA 检 测 试剂 盒 () 产生 ,有助 于 树 突 状 细 胞 诱 导 Th2 反 应 。试 验 证 达科为公司。 1 . 2 各种检测指标的引物设计 荧光定量 PCR 引 明 , IL210 可能通过抑制 DC 的分化成熟作用来降低 ( DC 的 抗 原 递 呈 能 力 Moo re 等 , 2001 ; 王 良 华 等 , 物设计及合成由大连 Ta Ka Ra 公司完成 ,其序列见 ) 2004,所以本试验采用 IL210 来影响 DC 的免疫调表 1 。 表 1 荧光定量 PCR 引物 ( )基因 引物 引物序列 5′ϖ3′ GenBa n k 登录号 βN M008361 I L21 上游引物 TCCA GGA T GA GGA CA T GA GCA C GA A C GTCA CA CA CCA GCA GGT TA 下游引物 M25892 I L24 TC TC GA A T GTA CCA GGA GCCA TA TC 上游引物 A GCA CC T T GGA A GCCC TA CA GA CCA 下游引物 N M031168 I L26 C T TCA CA A GTC GGA GGC T TA 上游引物 GCA A GT GCA TCA TC GT T GT TCA TA C 下游引物 M37897 I L210 GA CCA GC T GGA CA A CA TA C T GC TA A 上游引物 GA TA A GGC T T GGCA A CCCA A GTA A 下游引物 αN M008337 I L212 T GTC T TA GCCA GTCCC GA A A CC 上游引物 TC T TCA T GA TC GA T GTC T TCA GCA G 下游引物 γ C GGCA CA GTCA T T GA A A GCC TA N M008351 I F N2 上游引物 下游引物 GT T GC T GA T GGCC T GA T T GTC T GT GTCC GTC GT GGA TC T GA N M008084 上游引物 GA PD H T T GC T GT T GA A GTC GCA GGA G 下游引物 1 . 3 方法 收稿日期 :2009206203 ( ) 1 . 3 . 1 DC 培养 参考 Ka yo 等 1992的方法 ,并 ( ) 作者简介 :郎需龙 1978 - ,男 ,陕西人 ,助理研究员 ,研究方向 : 经改进来培养 DC ,具体操作如下 :无菌分离 C57 bl/ 分子免疫学 。 6 小 鼠 胫 骨 及 股 骨 , 用 1 mL 注 射 器 吸 取 R PM I2 ( ) 通信作者 :王兴龙 1959 - ,男 ,内蒙古人 ,博导 ,研究员 ,从事微 1640 培养液冲洗骨髓细胞 , 1000 r/ mi n 离心 5 mi n生物学与分子免疫学 。E2mail : wxl22006 @163 . co m , 洗涤 ,加入 5 mL 无菌 Tri s2N H4 Cl 溶液悬浮细胞 ,Tel :0431286985951 室温静置 2 mi n 裂解红细胞 ,再次 1000 r/ mi n 离心 6 1 . 3 . 5 荧光定量 R T2PCR 检测受染细胞内细胞因 5 mi n 。RM P I21640 洗涤后以 1 ×10个/ L 细胞密 度接 种 于 6 孔 培 养 板 , 培 养 液 中 含 有 r m GM2CSF 子的表达 采用 Trizol 并参照 说明 书提 取 细胞 总 () ( ) ( 10 ng/ mL 、r m IL24 2 ng/ mL 、10 %胎牛血清 、青 RN A 。紫外分光光度计测定总 RN A 的纯度 A/260 5 ( ( ) 进行 RN A 定量 。采用 R T2PCR 试剂 ) ),霉素 1 ×10U / L 、链霉素 100 mg/ L ,在 37 ?、 A280 > 118 β盒以荧 光 定 量 PCR 测 定 IL21、IL24 、IL26 、IL210 、 5 % CO、饱和湿度条件下培养 48 h , 弃悬浮细胞 。 2 αγIL212、IFN2等 m RN A 表达水平 。引物浓度为 20 第 3 天 半 量 换 液 , 补 足 细 胞 因 子 。第 6 天 添 加 含 ( μ L PS 的 R PM I21640 培 养 液 L PS 浓 度 为 10 g/μμmol/ L 、探针浓度为 10mol/ L 。反应条件 :95 ?预 ) mL ,补足相应细胞因子及血清 ,继续培养 2 d ,获取 变性 15 s ;94 ? 5 s ,60 ? 31 s ,40 个循环 。然后 , 用比较阈值法分析不同样品中细胞因子基因的相对成熟树突状细胞 。试验前用吸管轻轻吹打后收集所 () 有悬浮细胞 ,即为富集的小鼠骨髓来源的树突状细 表达量 ,计算方法参考崔丽谨 2008的方法进行 。 胞 。经流式细胞仪鉴定纯度达 80 %以上后可作下 1 . 3 . 6 细胞因子的 EL ISA 检测 按照 EL ISA 检 一步试验使用 。 测试剂盒说明书进行 。 1 . 3 . 2 1 . 3 . 7 统计 用 SPSS 13 . 0 软件进行统计分析 ,结TC ID的测定 FMDV W FL 株的培养及 50 () 病毒滴度测定按崔丽谨 2008的操作方法进行 。 果以平均数 ?误表示 , P < 0 . 05 作为显著性判 IL210 抑 制 及 中 和 试 验 1 . 3 . 3 在 FMDV 感 染 定标准 。 DC 前 24 h 分别加入相关抗体及细胞因子 ,其中各 2 结果与分析 μ 2 . 1 IL210 对 DC 分泌细胞因子转录水平的影响 在种细胞 因 子的 浓度 为 : IL210 抗 体 5 g/ mL 、IL210 培养液中加入 r m IL210 ,通过 FMDV 感染 DC 后 , 20 ng/ mL ,然后分别进行病毒感染试验 。 1 . 3 . 4 FMDV 感染 DC γ IL212 、IFN2在细胞中的转录水平下 降 较为 明显 , 将 100 倍 TC ID50 的 FM2 6 IL24 、IL26 、IL210 的转录水平有所升高 。在加入 IL2 DV 分别滴加于 1 ×10个/ mL 的 DC 中 ,37 ?培养 10 中和抗体后 , IL21 、IL24 、IL26 、IL210 的转录水平箱孵育 2 h , PB S 洗涤 3 次 ,换新鲜培养液继续培养 (γ) () 有所下降 ,而 IFN2转录水平有所升高 表 2 、3。含细胞因子及血清等,在 48 h 后分别进行检测 。 表 2 IL210 对 DC 感染口蹄疫后细胞内细胞因子 mRNA 水平的影响 - ??Ct( )( )?Ct DC + IL210 Ct DC + FMDV + IL210 ??Ct 2 ( )IL21 9 . 59 ?1 . 64 ?1 . 9275 ?1 . 9275 ,4 . 1411 9 . 4675 - 0 . 1225 1 . 0886 0 . 2682IL24 ( ) 3 . 96 ?1 . 112 . 2725 ?0 . 925- 1 . 6875 ?0 . 9253 . 2210 1 . 6906,6 . 1156IL26 ( ) 6 . 36 ?2 . 24 . 7375 ?1 . 8225- 1 . 6225 ?1 . 82253 . 0791 0 . 8706,10 . 8905( ) IL210 10 . 9 ?3 . 978 . 48 ?0 . 87- 2 . 42 ?0 . 875 . 3517 2 . 9282,9 . 7811 ( ) IL212 9 . 325 ?3 . 2859 . 5525 ?0 . 263330 . 2275 ?0 . 263330 . 8541 0 . 0358,0 . 7116 γ ( ) IFN212 . 555 ?0 . 395 15 . 5825 ?2 . 6775 3 . 0725 ?2 . 6775 0 . 1189 0 . 0186,0 . 7605 表 3 IL210 抗体对 DC 感染口蹄疫后细胞内细胞因子 m RNA 水平的影响 - ??Ct)( )( ?Ct DC + IL210 抗体 Ct DC + FMDV + IL210 抗体 ??Ct 2 ( )IL21 2 . 8700 ?0 . 0600 ?0 . 0800 ?0 . 0800 ,0 . 9931 2 . 9600 0 . 0900 0 . 9395 0 . 8888IL24 ( ) 12 . 6925 ?0 . 827513 . 3100 ?1 . 19000 . 6175 ?1 . 19000 . 6518 0 . 2857,0 . 6725IL26 ( ) 5 . 5700 ?0 . 11005 . 5475 ?1 . 0825- 0 . 0225 ?1 . 08250 . 4660 0 . 4649,0 . 4796 ( ) IL210 8 . 7667 9 . 7900 1 . 0233 0 . 4920 0 . 1826?0 . 7733?1 . 4300?1 . 4300,1 . 3256 ( ) IL212 15 . 5067 ?1 . 706715 . 5767 ?0 . 26330 ?0 . 26331 0 . 8332,1 . 2002 γ ( ) IFN214 . 0400 ?1 . 6900 12 . 9300 ?3 . 2400 - 1 . 1100 ?3 . 2400 2 . 1585 0 . 2285,20 . 3930 在 加 入 2 . 2 IL210 对 DC 分泌细胞因子的 影响 应用 IL210 的抗体可以颉颃 IL210 对 DC 成熟的抑 ( 制 ,通过该 手 段能 够打 破 不成 熟DC引起 的 免疫 耐) r m IL210 后 ,仅 IL210 的量有所增加 P < 0 . 05。而 表 4 使用 IL210 后 DC 所分泌细胞因子 EL ASA 检测结果 γ在加入了 IL210 抗体后 , IL212 和 IFN2的分泌量都 DC + IL210 DC + IL210 + FMDV ( ) 有所增加 , IL210 的分泌量下降 P < 0 . 05 ,其余差 IL21 593 . 3830 ?84 . 2496 ?165 . 5504 514 . 8185 () 异不显著 表 4 、5。 IL24 63 . 2770 ?30 . 379270 . 5458 ?49 . 8545 3 讨论IL26 325 . 2460 ?95 . 2159311 . 0120 ?105 . 191933IL210 105 . 7437 ?26 . 6371 227 . 1171 ?26 . 6651 Th1 细胞和 Th2 细胞可通过各自分泌的细胞 IL212 667 . 8076 ?126 . 9981669 . 2398 ?113 . 8163 因子 相 互 调 节 , Th2 通 过 分 泌 的 IL210 显 著 抑 制 γ IFN2162 . 2208 ?47 . 0480 155 . 6458 ?60 . 6808 ( ) Th1 分泌细 胞因 子及 相 关功 能 王良 华等 , 2004 。 ( ) 注 : 3 表示同行数据差异显著 P < 0 . 05 。下同 。 表 5 使用 IL210 抗体后 DC 所分泌细胞因子 减少 IL212 的分泌 , 进而减弱 DC 的抗原递呈功能 EL ASA 检测结果 ( ) Hoff ma n 等 ,2003。从本试验可见 ,在中和了 IL2 DC + IL210 抗体 DC + IL210 抗体 + FMDV 10 后 IL212 的转录水平没有增加的趋势 ,这可能是 IL21 466 . 1933 ?118 . 1757 344 . 1678 ?99 . 0435 因为在感染过程中多种因素导致 DC 分泌细胞因子 IL24 62 . 9252 ?15 . 171957 . 7667 ?17 . 5587 的能力发生改变所致 。 IL26 340 . 9897 ?86 . 2057367 . 9480 ?138 . 100833 IL210 228 . 8864 ?53 . 3148 116 . 4302 ?33 . 0915 参 考 文 献 33 IL212 432 . 5786 ?81 . 9388 735 . 1182 ?158 . 3590 33 γ IFN2141 . 6192 ?47 . 2480 298 . 5425 ?115 . 0899 1 王良华 ,熊文. IL210 对培养的树突状细胞影响的研究 [ J ] . 现代 ( ) 检验医学杂志 ,2004 ,19 1:19,21 . 受 ,使成熟的 DC 发挥应有的功能 。但这个过程中 马丽娜 ,赵中夫. DC IL210 与慢性乙型肝炎的关系研究进展 [ J ] . 2 ( ) 长治医学院学报 ,2006 ,20 4:318,320 . 需考虑到使用 IL210 抗体后是否会引起机体抗感染 刘峥嵘 , 张敏 , 黎纬明 , 等. IL210 诱导小鼠树突状细胞耐受的分 能力的降低 ,以及由此产生的对机体免疫力的影响 。 3 ( ) 子机制[J ] . 中国病理生理杂志 , 2008 ,24 2: 374,378 . 张涛 ,田丽芳 ,张爽 ,等. 口蹄疫 146 S 病毒粒子抗原对微血管内皮 ( ) B roo k s 等 2008 认为 IL210 的分泌及活性的 降 低( ) 细胞分泌 IL21 的影响[J ] . 中国畜牧兽医 ,2008 ,35 11:62,65 . 4 都是对一些慢性病毒感染以及核酸疫苗免疫失败后 崔丽谨. 利用 RN A 干扰技术抑制口蹄疫病毒复制与感染的研究 预防慢性病毒感染的有效补充 ,所以在研究中具有 [ D ] . 长春 :吉林大学 ,2008 . 5 Brockman M A , Kwo n D S , Tighe D P ,et al . IL210 i s up regulat2 重要的作用 。在本试验中发现 ,使用 IL210 和 IL210 ed i n multiple cell t yp e s duri ng vi re mic H IV i nf ectio n a nd rever s2 抗体处理 DC 后 ,影响 DC 感染 FMDV 后分泌细胞 6 i bl y i n hi bit s vi r u s2sp ecific T cell s[J ] . Bloo d ,2009 Ap r 13 . [ Ep ub 因子的能力 ,造成机体的免疫调控发生变化 。 a head of p ri nt ] 未成熟 DC 在成熟迁移过程中可以诱导调节性 Broo k s D G , L ee A M , El sae sser H ,et al . IL210 blockade f acili2 T 细胞产生 ,而体外培养未成熟的 DC 细胞时加入 t at e s DN A vacci ne2i nduced T cell re spo n se s a nd en ha nce s clear2 7 ( ) IL210 可以抑制成熟 , 从而造成 机体 免疫 系统 处 于 ance of per si st ent vi r u s i nf ectio n [ J ] . J Exp Medm ,2008 ,205 3: 533,541 .( 耐受状态 ,促使一些病毒发生慢性感染 马丽娜等 , Hoff ma n S J , Polack F P , Hauer D A ,et al . Mea sle s vi r u s i nf ec2 ) 2006。在慢性感染动物的体内 ,由于免疫状态的变 tio n of r he su s macaque s aff ect s neut rop hil exp re ssio n of IL212 8 化造成 Th1/ Th2 细胞因子的分泌失衡 ,具体表现为 ( ) a nd IL210 [J ] . Vi ral Immunol ,2003 ,16 3:369,379 . Th2 类细胞因子的应答占有优势地位 ,导致机体不 Kayo I , Muneo I , Ni kolau s R , et al . Generatio n of lar ge nu mber s (能有效清除受病毒感染的细胞 ,造成持续性感染 刘 of dendritic cell s f ro m mo u se bo ne ma r ro w cult ure s supple ment ed 9 wit h granulocyt e/ macrop hage colo ny2sti mulati ng f acto r [ J ] . J () ) 峥嵘等 ,2008。B rock ma n 等 2009认为 ,在慢性病 ( ) Exp Med ,1992 ,176 12:1693,1702 . 毒感染的过程中 ,如果 IL210 的浓度增加对机体清 Moo re K W , De Waal M R W , Coff ma n R L , et al . Int erleu ki n2 除病毒具有抑制作用 ,阻断 IL210 的分泌或降低 IL2 10 a nd t he i nt erleu ki n210 recep to r [ J ] . A nnu Rev Immnol , 10 10 的活性则将是一个具有一定前景的清除病毒的 2001 , 19 :683,765 . Sung S S. Mo nocyt e2derived dendritic cell s a s a nti gen2p re senti ng 治疗方法 。尽管关于 IL210 对 DC 的抑制机理还不 cell s i n T2cell p rolif eratio n a nd cyto ki ne p ro ductio n [J ] . Met ho ds 清楚 ,但 DC 在发挥免疫作用时会分泌 IL212 ,而 IL211 Mol Med , 2008 ,138 : 97,106 . () 10 对吞噬细胞 如树突状细胞中的 I L212 基因转 录具有明显的作用 ,能够抑制 DC 中 IL212 的表达 , The Eff ects of IL210 on Den drit ic Cell s Inf ected by Foot2and2mout h Virus L A N G Xu2lo ng , WA N G Xi ng2lo ng , SU N Ch un2h ui , Z H A N G F u2xia n , B U Zhao2ya ng , L U Hao , TA N G J ie , DA N G Yua n , WA N G Yi ng2chao ( )The Milita ry Veterinar y Instit ut e , Academy of Milita r y Medical Science s of PL A , Cha ngchun 130062 , China () ( ) Abstract : Dendritic cell s DCa re t he mo st po tent antigen p re senting cell s A PCof t he immune system , so it ha s a sp e2 cial place in induce of immune respo nse . We t ho ught t hat IL210 have impo rta nt eff ect s t hro ugh t he p roce ss of viral inf ectio n. In t hi s resea rch t he IL210 a nd IL210 neut ralizing a ntibo dy were used to regulate t he immune st ate of DCs when t hey were inf ected by FMDV s , t he re sult s sho wed t hat IL210 ca n aff ect t he immune regulatio n in t he co ur se of FMDV inf ectio n. Key words : IL210 ; foo t2a nd2mo ut h vir us ; dendritic cell s