三种食管鳞癌细胞系的染色体异常研究

三种食管鳞癌细胞系的染色体异常研究 ?中国癌症杂志》2005基蒡15卷第5期 CHINAONCOLOGY2005Vol15No.5 三种食管鳞癌细胞系的染色体异常研究 [摘要】目的:舒析食管鳞痴(ESCC)细胞系的染色体异常.为将来寻找食管癌相关基因提供线索方法:采 用比较基因组杂交法(CGHj丹析3种ESCC斟日胞系的染色l悻DNA辑数改变情况结果:9q(3/3),3q(2/3).5q (1/3),5p(2/3】,8q(2/3),12p(2/3)和20q(2/3)为常的染色体增l『?医4q(2/3)和6q(2/3)是常见的染色体丢 失区结论:这些常见的染色件异常有助于寻找和定位食管癌相关旗因. [关键词]食管癌;染色体;培养的种瘤细胞;比较基囡组杂交 中图分类号:R73—354文献标识码:A文章编号:【(一3639c2005】05~4464)4 Chromosomalaberrationsin3esophagealsquamouscellcarcinomacellfinesLIA..一yun.5 Min,ChinS,?,,.Department(pathology.?;han~ouUniversityMedicalCollege,Shant~mGuang- dong,515031,China;2.Huschison/MRCResearchCeutreiversityCambridge.HilLsRocut,Cam— bridgeCB22ZL”K.J 【Abstract】Purpose:TlllFgenetJlaberrali,:msl}lllirll~Ie~-,phageMNqIIitfllOllScell~.tarl?inotnaIEsCc1,f1nI- vidingthlueslotidentilyingtheII皿0?t~ophageal.el”cEC)-relale,Igetl(~sMethods:Weim,estigaled(.hromo— somalDNAcopynunt]~rchangesin3ESCC~:elllineshy’-,?ILm_lHnnm_lhybridization(CGH】Results:9qc3,3l,3q c2/3),5qf2 门}.5r(2/3).8q2/3),12p(2/3)and20(tI2/3l…I~equetttchrn…,n1gainregions.and4q12/’3}and6~I (2/3)wemfrecpmntlm)…lsm,l?Conclusions:r’ht’~e(:Om~lorl(:ht’llnlosom~t[a[,normaliliesmayh elptnidentify candidategenesrelaledtue~)phagealIlmr lKeywords】Esophageal?[.r:(:hlX)rflosorJlt!~<:ahur~l[tll/1OFcells:comparativegenomichylwidivation 食管癌(EC)根据组织学分型主要有鳞癌(ES一 (:c)和腺癌(EAC)两种在洲的食管癌高发[. 如伊朗里海沿岸’,印度克仆米尔及中国的太行 山区和潮汕地区”,绝大多数的食管癌以ESCC为 主.研究发现在环境因素方面,ESCC豹发生可能 与吸烟和饮酒有关.而美国和西欧在过去的几十年 里EAC的发生呈明冠增加趋势,ESCC的发生率保 持相对稳定,大部分EAC与食管Bm’ret}’s上皮 有关EC发生常具有家旗聚集性.种族差异性等特 点,说明遗传因素在EC发生中具有重要作用E(: 遗传改变除l『基因异常外,述存在多种与EC发乍 和演进有关的染色体异常,这些异常可影响染色体 基金项目:国家自然科学基盘国际台怍熏点项目3ff210103904) 东省十五攻关项日(l0203). 第一怍者简介:李晓昀,女,讲师,障士生 g—mai/?stu[/xy@l1.r,m?’n 通信作者简介:苏被,男,教授,博上生导师. E.mail:m[nst,@stuedu0[I 上EC相关基因的达,如原癌基因激活或肿瘤抑 制基图失活等而促进EC发生90年代出现的比较 基因组杂交技术(CGH)尤其适用于染色体制备 比较困难的实体瘤遗传学研究我们用CGH技术 斜究3种ESCC细胞系的全基因组DNA拷贝数改 变情况.可为将来寻找和定位食管癌相关基因提供 有用线索. 1材料和方法 11材料选取3种食管鳞癌细胞系(KYSE30 OE2l,H5E973”)为实验对象.除H5E973细 胞系外,其余细胞系均由英国剑桥大学医学院提供 H5E973细胞系由中科院院士曾毅教授和我院沈忠 英教授台作研制而成的,是HPVI8E6E7基因转染 人胚食管上皮细胞建立的具有恶变趋向的永生化细 胞系.取其已恶变为鳞癌细胞的第1130代作为研究 对象. 1.2DNA抽提用BIO-RAD公司的AquapureGe— 《中国癌症杂志》2005年第15卷第5期 n0micDNAKit提取KYSE30,OE21和男性健康志愿 者外周血DNA.用Gentra公司的Puregene,DNAI- solationKit提取H5E973的DNA. l-3比较基因组杂交(CGH)CGH主要根据 Kallioniemi等提供的步骤进行.用DOP-PCR扩 增和标记DNA?,其中生物素一dUFF(RocheBio? chemicals)标记正常参照DNA,地高辛-dUFF(Roche Biochemicals)标记3个细胞系DNA.按常规方法制 备正常男性外周血淋巴细胞中期染色体标本.所有 标记的DNA一同与外周血淋巴细胞中期染色体片 杂交,37?温育48小时,然后用结合Cy3的链霉亲 和素(Amersham,UK)及结合FITC的抗地高辛抗体 (RocheBiochemicalsUK)检测染色体片. :1.4结果观察用SmartCaptureVP软件(Digital ScientificLtd.,Cambridge,UK),通过ZEISS公司 AxioplanII荧光显微镜捕获CGH图象.用Quips CGH分析软件(VysisInc.)对CGH图象进行分析, 得到每种食管鳞癌细胞系的染色体绿色荧光(标记 食管癌细胞DNA)和红色荧光(标记正常DNA)的 比率及其分析图.正常染色体绿红荧光比率变化一 般在0.8,1.2之间,大于1.2表示肿瘤细胞DNA 拷贝数增加,小于0.8表示肿瘤细胞DNA拷贝数丢 失.每种食管鳞癌细胞系分析8—25个核型,综合 分析后得出代表该细胞系每号染色体DNA变化的 结果 2结果 通过CGH检测到的3种食管鳞癌(ESCC)细胞 系(KYSE30,OE21,H5E973)的染色体DNA拷贝数 增加和丢失情况(详见图1和表1).表2列出了3 种ESCC细胞系常见的染色体增加区和丢失区.9q (3/3),3q(2/3),5q(2/3),5p(2/3),8q(2/3),12p (2/3)和20q(2/3)为常见的染色体增加区,增加的 最小重叠区分别位于9q32-34,3q26.3-qtel,5q35- qtel,5p15.1-ptel,8q24-25,12p13-ptel和整条20q. 4q(2/3)和6q(2/3)是常见的染色体丢失区,但丢 失区不重叠. 在H5E973细胞系检测到9q34和整条20q呈 现高水平扩增. xV 图1CGH检测的3种食管鳞癌细胞系DNA拷贝数改变 染色体左侧竖线表示DNA丢失的染色体区范围,右侧竖线表示 DNA增加的染色体区范围.(绿色竖线代表KYSE30细胞系;红色 竖线代表OE21细胞系;蓝色竖线代表H5E573细胞系). 表13种食管鳞癌细胞系的染色体异常 表2食管鳞癌细胞系的主要染色体增加和丢失区(n:3) 3q 5q 5p 8q 12p 20q 2/36q2/3 2/3 2/3 2/3 2/3 2/3 在对3种食管鳞癌(ESCC)细胞系的比较基因 组杂交(CGH)研究中,我们观察到这3种细胞系均 存在涉及多条染色体的DNA拷贝数改变,这些改变 以染色体增加为主,相应染色体的增加区域有重叠. 由于本研究所检测到的染色体丢失仅常见于4q和 6q,且丢失区不重叠,而且CGH以检测染色体区域 的增加更为敏感,因此我们着重讨论这3种细胞系 1『?薯rI摹?嗣冒嚏R _昌乱,旨-I_l?量曰I=昌暑III 目噶旧.一lU-L_暑一蛩1.一誓『)n 宣【】置.-lE.一8 旨?IJI=L暑I_JJ-暑?一一一二ll一_目 李晓昀,等.三种食管鳞癌细胞系的染色体异常研究 常见的染色体DNA拷贝数增加的异常及其可能涉 及的候选食管癌相关基因. 本研究中3种ESCC细胞系均有9q的增加,而 9q34不仅是9q增加的最小重叠区,也是在H5E973 细胞所检测到的高水平扩增区,正好与Shinomiya 等?在一个ESCC细胞系观察到的高水平扩增区 9q34一致.9q34可能涉及与ESCC有关的癌基因 的扩增. 多项ESCC的研究常报道3q的增加?J,而 我们也在2种ESCC细胞系检测到3q的增加,增加 的最小重叠区3q26.3-qtel恰好与Pimkhaokham 等?在ESCC细胞系发现的高水平扩增区3q26和 3q27.28相重合.既往ESCC的CGH研究_1川表明 3q的增加可能与肿瘤的演进有关. 关于5q频繁增加的报道少见,而更多研 究H表明ESCC和EAC常发生5q14-21, 5q12?21,5q21-23的丢失.我们2种ESCC细胞系 出现5q的增加,增加的最小重叠区5q35.qtel位于 文献所述的5q常见丢失区的更远端,5q35.qtel可 能含有与食管癌有关的癌基因. 与文献报道的Barrett腺癌和ESCC12]的 12p增加的常见最小重叠区和高水平扩增区位于 12p近端12pl1.2.12处相比较,我们在3种ESCC 细胞系中所检出的12p频繁增加主要集中的远端区 12p13.ptel可能与ESCC发生关系更为密切. 多项研究m,,.,表明ESCC和EAC 常出现5p,8q,20q增加,5p14.15,8q23-24,整条20q 不仅是相应染色体增加的最小重叠区也是高水平扩 增区.类似的结果也存在于我们的研究中.我们在 ESCC细胞系观察到5p,8q,20q的频繁增加(频率 均为2/3),增加的最小重叠区为5p15.1.ptel,8q24. 25,和整条20q,其中整条20q在H5E973细胞系还 表现为高水平扩增.因此位于这些染色体区域内的 基因MLVI(5p14),C?MYC(8q24),AIB1(20q), BTAK(20q),SRC(20q),MYBL2(20ql3.1),lYFPN1 (20q13)可能就是食管癌的候选癌基因. 3种ESCC细胞系除了相似的染色体异常外, 还存在不同的染色体异常,这一方面可能与它们的 来源不同有关,KYSE30和OE21细胞系分别由日本 和高加索的ESCC患者的癌组织建立的], H5E973细胞系是HPV18E6E7基因转染中国人胚 食管上皮细胞而建立’加J.另一方面由于肿瘤的发 生和演进过程中染色体的变化是及其复杂的,肿瘤 组织存在异质性,这可能也是3种ESCC细胞系表 现出不同染色体异常的原因.ESCC细胞染色体的 异常还有待于我们更深入的研究. 总之,3种ESCC细胞系的CGH研究表明,9q (3/3),3q(2/3),5q(2/3),5p(2/3),8q(2/3),12p (2/3)和20q(2/3)为ESCC细胞系常见的染色体增 加区,我们可用免疫荧光原位杂交(FISH)和杂合性 丢失(LOH)等技术对这些区域做进一步深入研究, 有助于寻找和定位食管癌候选癌基因. 致谢:Prof.BruceAJPonder,Director.Hutchison/MRCRe— searchCentre&MRCCancerCellUnitandDepartmentofOn— cology,UniversityofCambridge,UK,forhisvaluablesugges— tion,andprovidedlaboratoryandreagents. 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(收稿日期:2005-01—12修回13期:2005-03-21) 2讯等.《中国癌症杂志》已人选中国科技核心期刊及全国肿瘤类核心期刊,并为中国科技论 文统计源期刊, 先后被”中国期刊网”,”万方数据——数字化期刊群”和”解放军医学图馆数据库(CMCC)” 等收录. 2《中国癌症杂志》为月刊,大l6开,80页铜版纸(随文彩图),每月5日出版,单价8元,全年96 元. 国际刊号1007—3639,国内统一标准刊号CN31—1727/R,邮发代号4—575. 2读者可在当地邮局订阅,漏订者可直接向本刊编辑部订阅. 联系地址:上海市东安路270号复旦大学附属肿瘤医院内《中国癌症杂志》编辑部 : 2邮编:200032 n i电话:(021)64188274;(021)64175590-3574 2传真:(021)64188274 E—mail:zgaz@chinajourna1.net?cn .......<>...............................................................<.................