【doc】慢性捆绑应激致大鼠学习记忆受损及海马神经元突触素和突触后致密物95表达的变化

【doc】慢性捆绑应激致大鼠学习记忆受损及海马神经元突触素和突触后致密物95达的变化 慢性捆绑应激致大鼠学习记忆受损及海马神经元突触素和突触后致密物95表达的变 化 第32卷第4期第367页 2003年8月 华中科技大学(医学版)Vo1.32No.4P.367 JHuazhongUnivSciTech[HealthSci]Aug.2003 慢性捆绑应激致大鼠学习记忆受损及海马神经元 突触素和突触后致密物95表达的变化* 廖敏刘能保?张敏海李宏莲刘少纯刘向前张伟 华中科技大学同济医学院基础医学院解剖学系,武汉430030 摘要目的了解慢性捆绑应激对大鼠学习记忆能力的影响及可能的神经解剖学机制.方法将大鼠分为应激组 和正常对照组,应激组大鼠每天捆绑6h共21d,然后用Y迷宫对2组大鼠进行行为检测,运用免疫组织化学方法, 观察2组大鼠海马突触素和突触后致密物96(PSD-95)的表达,并用计算机图像分析仪对免疫反应结果进行处理. 结果应激组大鼠学习记忆能力明显受损(P<O.05);其海马CA.区突触素和PSD-95免疫阳性产物较对照组明显减 少(P<O.01).结论慢性捆绑应激致大鼠学习记忆受损可能与其海马神经元突触素和PSD-95的表达减少有关. 关键词学习与记忆;慢性捆绑应激;突触素;突触后致密物95;海马 中图法分类号R322.81 TheChangeofSynapsinandPSD-95ExpressionintheHippocampal NeuronsofRatswithLearningandMemoryImpairmentby ChronicRestraintStress LiaoMin,LiuNengbao,ZhangMinhaietal DepartmentofAnatomy,SchoolofBasicMedicalSciences,TongJiMedicalCollege, HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030 AbstractObjectiveTostudytheeffectofchronicrestraintstressonratlearningandmemoryand thepossibleneuroanatomymechanism.MethodsRatsweredividedintostressandcontrolgroups.The stressratswererestrainedfor6heverydays.21dayslaterthebehaviorwastestedintwogroupsbyY— maze.Theexpressionofthesynapsinandthepostsynapticdensity95(PSD-95)intwogroupShippocam— puswereobservedbyusingimmunocytochemicalmethodandtheresultswereprocessedbycomputerimage analysissystem.ResultsThelearningandmemoryabilityofthestressratswasimpaired(P<0.05). TheimmunoreactivitiesofthesynapsinandthePSD-95weredecreasedinhippocampalCA3areasofthe stressrats.ConclusionTheimpairmentoflearningandmemoryabilityofthestressratsmightberelated withthechangeofthesynapsinandthePSD-95inhippocampalneuronsoftherats. Keywordslearningandmemory;chronicrestraintstress;synapsin;postsynapticdensity一 95; 应激是HanSalye于20世纪30年代提出的一 '国家自然科学基金资助项目(No.30270446) 廖敏,女,1970年生,医学硕士,讲师.现址:咸宁医 学院组织胚胎学教研室,咸宁437100 通讯作者 种在内外环境剧变的刺激下,机体出现的综合应答 状态.海马与学习记忆关系密切,多年来已成为研 究学习与记忆神经机制的重要结构口].慢性应激可 选择性损伤海马,引起认知功能下降,这种损伤与 脑的退行性变化非常相似.突触是神经元相接触部 分的特化区,是神经元实现生理功能的关键性部 ? 368?华中科技大学(医学版)2003年8月第32卷第4期 位.突触素位于轴突终末的突触囊泡膜上,能调节 神经递质的释放,且在突触可塑性的发生过程中具 有不可忽视的作用.突触后致密物(postsynaptic density,PSD)是位于突触活性区突触后膜下方与 胞浆相连的一层致密物质,PSD-95串集N一甲基 I)_门冬氨酸(N—methylD-aspartate,NMDA)受 体,此受体是诱发长时程增强的必要条件,而长时 程增强是学习和记忆形成的突触可塑性模式.过去 大量研究表明,海马结构内与学习记忆相关的部位 主要是齿状回,('A.及CA区.在本实验条件下受 影响明显的是海马齿状回和CA.区.我们采用机 械捆绑的方法束缚动物使之处于紧张应激状态.用 免疫组织化学SABC法观测大鼠海马CA.区及齿 状回突触素和PSD-95表达的变化,以探讨慢性捆 绑应激引起的认知缺失的神经解剖学机制. l材料和方法 1.1买验动物分组及行为买验 3月龄雄性Wistar大鼠16只,由同济医学院 实验动物学部提供,体重240g左右,随机分为对 照组和应激组,每组8只.应激组大鼠每天用捆绑 器捆绑6h,连续捆绑21d,对照组不给予此刺 激.2组动物于第22d用Y迷宫测试其空间辨别 作业的学习与记忆能力.行为测试参照舒斯云纠报 道的方法. 1.2灌注取材 第23d动物经7水合氯醛腹腔注射麻醉, 经左心室快速灌入37C生理盐水100ml,接着滴 注400ml4多聚甲醛固定液,取含海马脑段, 人上述固定液中固定12h.梯度酒精脱水,透明, 石蜡包埋,冠状连续切片,片厚6p.m.切片分两 套分别进行突触素和PSD-95免疫组织化学反应. 1.3免疫组织化学染色 切片脱蜡到水,室温经正常羊血清封闭,3O min后,依次入鼠抗突触素单克隆抗体(1:800) 或鼠抗PSD-95单克隆抗体(1:500美国德克萨斯 州大学西南医学院赠送)4C孵育48h;生物素化 羊抗小鼠IgG(1:100,武汉博士德)37C孵育 2h;SABC(1:100,武汉博士德)37.C孵育2h; 0.05DAB室温显色5,10min,终止反应.以 上各步骤间用0.01mol/LPBS充分洗涤.对照实 验:用0.01mol/LPBS代替一抗孵育切片,结果 均成阴性反应. 1.4显微图像分析' 每只动物取6张切片,每张切片的CA.区和齿 状回各取3个视野,用HPIAS-1000高清晰度彩色 病理图文分析系统对其免疫反应产物进行吸光度测 定,并以胼胝体吸光度作为基准,得到校正值.实 验数据以-4-表示,用t检验作差异显着性分析. 2结果 2.1述宫测试结果 用达到9/1O所需的总电击次数表示大鼠 学习记忆成绩.应激组动物为(38.0?6.9)次, 对照组为(30.0?5.1)次,2组间的差异有显着 性(P<O.05). 2.2突触素免疫组织化学反应及定量分析结果 免疫反应产物为棕褐色颗粒状或点状,深染的 颗粒主要位于海马CA.区及齿状回.CA.区以辐射 层染色最深,腔隙分子层次之,始层很少;齿状回 以分子层染色最深.对照组CA.区免疫阳性反应 产物大而密集,应激组阳性颗粒染色浅而稀疏(图 1,2).从表1中可见,和对照组相比,应激组海 马CA.区突触素免疫反应产物吸光度显着减少(P d0.01).2组齿状回吸光度无显着性差异. 2.3PSD-95免疫组织化学反应及定量分析结果 PSD-95的免疫反应产物为细小的棕褐色颗粒, 反应产物弥散分布,主要位于CA.区和齿状回神 经元胞质中.对照组CA.区锥体细胞胞浆阳性颗 粒数量较多,染色深,应激组CA.区锥体细胞胞 浆阳性颗粒较少,染色浅(图3,4).和对照组相 比,应激组海马CA.区PSD-95免疫反应产物吸光 度显着减少(P<0.01).2组齿状回吸光度无显着 性差异. 表12组大鼠海马神经元突触素和PSD-95免疫反应产物吸光度比较(?S,一8) 与对照组比较P%0.01 廖敏等.慢性捆绑应激致大鼠学习记忆受损及海马神经元突触素和突触后致密物 95表达的变化?369? : . , 磁:': 图1实验组海马CA3区突触素免疫反应阳性产物×i00 图2对照组海马CA3区突触素免疫反应阳性产物×100 图3实验组海马CA3区PSD-95免疫反应阳性产物×400 图4对照组海马CA3区PSD-95免疫反应阳性产物×400 3讨论 Becker用损毁的方法观察不同脑区在空间学 习与记忆中的作用,发现只要海马系统完好,大鼠 就可精确地完成空间任务_3],推测大鼠的空间学习 与记忆的中枢定位可能在海马.Y迷宫能客观地检 测大鼠被动逃避及空间辨别类型的学习与记忆能 力l_4],因而成为一种常用的研究学习与记忆的检测 方法.本实验Y迷宫测试结果发现应激组达到学 会标准之前的电击次数明显高于对照组,两者间有 显着性差异,说明慢性捆绑对大鼠空间辨别的记忆 能力有明显的损害作用,其机制可能是持续应激造 成的与空间学习与记忆密切相关的海马结构发生改 变. 突触素是位于小突触囊泡上的囊泡吸附蛋白, 其磷酸化作用在神经递质的释放过程中具有重要作 用,是构成快速调节神经递质释放效率的调节系统 的组成部分l_5].Lu等的研究表明突触素能调节 新的神经末梢的形成,促进神经元功能成熟.另有 实验"]表明缺乏突触素基因小鼠的大脑显示苔藓纤 维终末较小且突触囊泡数量显着减少. PSD是化学性突触的一种亚微结构参数,位 于突触活性区突触后膜下方.研究表明,PSD对应 激反应很敏感,多种外界刺激可引起不同脑区 PSD的变化.生物化学分析已经证实PSD含有离 子通道,递质受体,微管蛋白,肌动蛋白等多种蛋 白质.PSD-95已鉴定为串集谷氨酸NMDA受体 的一种重要蛋白l8].它把NMDA受体限制在特定 位置,使之正好对应于突触前的神经递质释放 区,对突触点对点的传递起重要作用.长时程增 强是学习与记忆的神经基础l1,海马齿状回, CA区和CA.区的NMDA依赖性长时程增强的产 生需要NMDA受体的激活l_1. 应激使糖皮质激素过度分泌,糖皮质激素与海 马中糖皮质激素?型受体结合,抑制葡萄糖转运, 干扰能量代谢,降低供能,一方面引起海马神经元 胞体受损,导致轴突终末变性,丢失,另一方面使 神经元代谢受阻,蛋白质合成能力下降,轴浆运输 减慢.糖皮质激素升高还影响Ca.的电导,导致 细胞内Ca.超载,高钙激活一系列与细胞毒性有 ? 370?华中科技大学(医学版)2003年8月第32卷第4期 关的酶,导致蛋白质分子构象的可逆性转变,最终 使突触素,PSD-95数量减少.由于突触素几乎存 在于所有神经元终末的突触囊泡膜上,所以可以作 为突触前终末的特征性标记物,用来检测突触的密 度和分布,其数量减少提示突触数量减少,突 触囊泡减少,从而影响递质的释放.PSD-95减少 反映突触后膜聚集的NMDA受体数量减少,且受 体的位置也发生改变,既影响长时程增强的形成, 也影响递质与受体的准确结合,最终在行为上表现 为学习记忆障碍.本实验中,慢性捆绑应激可能以 类似机制影响突触素和PSD-95的表达而导致学习 记忆受损. 参考文献 1ShenY.SpechtSM,GhislainIDSeta1.Thehippo— campus:abiologicalmodelforstudyinglearningand memory.ProgNeurobiol,1994,44:485 2舒斯云,包蓉,包新民等.大鼠纹状体边缘区与Mey— nert氏基底核的突触联系及学习记忆功能的关系.中 国组织化学与细胞化学杂志,1998,7(1):1 3BeckerJT,WalkerJA,OltonDS.Neuroanatomical baseofspatialmemory.BrainRes,1980,200:307 4StanesMD,BrownCP.Effectofphysostigmineony- mazediscriminationretentionintherat.Psychopharma— cologia,1976,46:269 5SilvaAJ,StevensCF,TonegawaSeta1.Deficient hippocampallong—termpotentiationinalpha-calcium- 6 8 9 11 calmodulinkinaseIImutantmice.Science,1992,257: 2O1 LuB,GreengardP,PooMM.ExogenoussynapsinI promotesfunctionalmaturationofdevelopingneuromus— cularsynapses.Neuron,1992,8:521 MagarinosAM,VerdugoJM,McEwenBS.Chronic stressalterssynapticterminalstructureinhippocam— pus.ProcNat1AcadSciUSA,1997,94:14002 KornauHC,SchenkerLT,KennedyMBeta1.Do— maininteractionbetweenNMDAreceptorsubunitsand thepostsynapticdensityproteinPSD-95.Science, 1995,269:1737 NusserZ,MulvihillE,StreitPeta1.Subsynaptlcseg— regationofmetabotropicandionotropicglutamaterecep— torsasrevealedbyimmunogoldlocalization.Neuro- science,1994,61:421 TeylerTJ,DiscennaP.Long—termpotentiation.Annu RevNeurosci,1987.10:131 ZalutskyRA,NicollRA.Comparisonoftwoformsof long-termpotentiationinsinglehippocampalneurons. 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