国产探针在荧光原位杂交FISH检测未培养羊水细胞性染色体中的应用

国产探针在荧光原位杂交FISH检测未培养羊水细胞性染色体中的应用 【摘要】目的 探讨国产探针在荧光原位杂交(FISH)检测孕中期 未培养羊水中胎儿性染色体的应用价值并优化实验方法。 方法 选择CSPX/Y探针对15例孕周介于18~23周的孕妇的羊水标本进 行FISH检测，同时对标本进行细胞培养和核型分析。 结果 14 例标本出现满意的杂交信号，1例结果不满意。检测结果与染色 体核型分析结果相符。针对实验中的不足，相应调整实验条件进 行，获得了较满意的结果。 结论 国产探针实验结果理想，其有 不足通过改进可以获得较满意的结果。 【关键词】 荧光原位杂交;产前诊断;羊水;国产探针 The Application of domestic probe in detection of sexual chromosome in uncultured amniotic fluid by fluorescence in situ hybridization Zhou Rongsheng,Cong Lin Department of Obstetrics and Gynecology, the First Affiliated Hospital of Anhui Medicine University, Hefei 230022,China [Abstract] Objective To optimize the methods and evaluate the value of domestic probe in detection of sexual chromosome in uncultured amniotic fluid cells by fluorescence in situ hybridization (FISH). Methods FISH was performed with domestic centromeric probe (CSPX/Y) on the uncultured amniotic fluid samples those from 15 pregnant women between 18-23 weeks gestational. The cultured samples were analyzed concurrently by cytogenetics. Results Fourteen samples hybridization signals appear well. One sample hybridization signal was not well. These results agree with the result of the traditional cytogenetics. A series of adjustments were performed and a more satisfactory result was obtained. Conclusion The experimental result of domestic probe is satisfactory but still inadequate. By improving the experimental conditions a more satisfactory result was obtained. [Key words] Automatic biochemical analyzer system; Measurement; Comparison;Evaluation 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH) 是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原 有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位 杂交技术。1986年，Cremer和Lichter等分别对荧光原位杂交 技术作为临床细胞遗传学诊断的有效手段和快速检测间期细胞核中染色体数目的特异性效果进行介绍，开辟了FISH技术在产前诊断领域研究的时代[1，2]。国内目前多采用进口探针进行研究，对国产探针的研究几乎空白。本实验采用国产探针对孕中期未培养的羊水细胞中胎儿性染色体快速诊断进行研究，对国产探针的实验条件进行探讨，其优缺点，研究其可行性与科学性，以期在获得快速、满意的产前诊断方法的同时，为国产探针最终在产前诊断中的推广和使用提供依据。 1 资料与方法 1.1 标本来源 选择2007年11月至2008年6月于合肥市第三人民医院妇产科因计划外妊娠要求引产的孕妇15例。所有孕妇实验室检查:血常规，凝血象，肝肾功能均为正常。全胸片，心电图结果正常。孕妇的年龄20~42岁，孕周选择在18~23周。所有提供羊水的孕妇夫妇均签署知情同意书。 1.2 羊水的采集 孕妇签署知情同意书后，在B超的引导下采用21 G的PTC-B(八光)穿刺针在常规消毒下经腹抽取羊水25 ml(2 ml行羊水常规检查，18 ml行染色体核型分析，5 ml行FISH检测)。 1.3 细胞遗传学诊断(染色体核型分析) 在无菌操作条件下用抽取的羊水装入无菌离心管内离心收集羊水细胞，采用贴壁细胞培养法培养10,14 d，见细胞生长良好加入秋水仙碱，收集羊水细胞，常规制片，G显带，每例镜下观察30个细胞的分裂象， 分析羊水细胞染色体核型。 1.4 分子遗传学诊断(FISH试验方法) 1.4.1 制片 ?留取的羊水离心去上清，用5 ml胶原酶B(Sigma C6885)[0.005 g/5 ml Hank's BSS(Sigma H6648)]均匀吹打后，置37 ?水浴锅30 min。?离心去上清后，加5 ml KCl低渗溶液(0.075M KCl提前在37 ?水浴锅预热10 min)，均匀吹打后，置37 ?水浴锅30 min。?依次加入固定液(甲醇:冰乙酸=3:1) 2 ml、5 ml、5 ml 3次固定，离心去上清至适宜体积后，滴片至少2张。?室温过夜老化玻片或56 ?烤片机上烤30 min老化玻片。 1.4.2 预处理 ?37 ?水浴锅中将60 μl RNase A(100 μg/ml)溶液与40 ml 2XSSC(生理盐水柠檬酸钠pH 7.0)溶液混合，玻片置入其中30 min。同时，将40 ml 0.01M HCl置于37 ?水浴锅中预热，将160 μl胃蛋白酶储存液加入至干燥预热至37 ?的考普林瓶中。?RNaseA溶液处理结束后，玻片室温下依次于2XSSC溶液中漂洗5 min×2次，0.1M HCl溶液中浸泡10 min;2XSSC溶液中漂洗5min×2次。?将已预热的0.01 M HCl倒入装有胃蛋白酶储存液的考普林瓶中混匀，将玻片置于37 ?胃蛋白酶溶液中浸泡10 min后，室温下于2XSSC溶液中漂洗玻片5 min×2次。?将玻片依次置于预冷的 70%、85%、100%乙醇中3 min、3 min、3 min脱水。自然干燥玻片。加热玻片至56 ?。 1.4.3 变性与杂交 ?7 μl 杂交缓冲液、1 μl 去离子水和2 μl 探针(CSPX/CSPY探针组，金菩嘉公司)组成探针混合物，于(78?1)?水浴锅中变性5 min，后将其置于45~50 ?水浴锅中，杂交前取出。?玻片置于(73?1) ?70%甲酰胺变性液中变性5 min后脱水。?变性好的探针混合物滴于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边。置于预热的湿盒中，42 ?保温箱中过夜杂交。 1.4.4 洗涤 玻片移去盖玻片，依次在预热(46 ?)的三瓶50%(V/V)甲酰胺/2XSSC溶液中洗涤，每次10 min， 2 XSSC中10 min，2 XSSC/0.1%NP-40(Amresco)溶液中5 min，室温下70%乙醇中浸泡3 min，取出玻片。 1.4.5 分析结果 暗处自然凉干玻片。将12 μl二氨基苯基吲哚(DAPI，金菩嘉公司)复染剂滴加于杂交区域位置，立即盖上盖玻片。暗处放置20 min后，在荧光显微镜(OLYMPUS-BX51)下选用合适的滤波片组观察荧光信号，计数、摄图保存并分析结果。 2 结果 CSPX/CSPY为一组探针，女胎显示两个绿色荧光信号，男胎显示一个红色荧光信号，一个绿色荧光信号。检测的15例标本中，细胞培养均成功并进行核型分析。FISH检测结果均在48 h内获得，其中14例出现满意的杂交信号，6例显示为两个绿色荧光信号(图1)。8例显示为一个红色荧光信号，一个绿色荧光信号(图2)，1例由于胞核变形，杂交信号不满意(图3，4)。杂交成 功率为93.3%(14/15)。与常规染色体核型分析结果符合率为100%(14/14)。(彩图见第2页)。 3 讨论 我国每年约出生100万出生缺陷儿，其中30%为遗传性疾病，而染色体病是导致新生儿出生缺陷最多的一类遗传性疾病。目前对染色体病尚无有效治疗方法，主要依靠产前诊断来预防缺陷儿的出生。 目前最常用的产前诊断实验方法是对羊水细胞培养后进行细胞学检查，耗时3周左右。在此期间，患者要承受巨大的心理压力。同时，因为取材时间有限，易污染，培养耗时长，结果取决于细胞中期分裂相的多少，染色体分散的好坏，显带的是否适中以及培养形成的假嵌合体均会影响结果。一旦培养失败，患者将面临脐血穿刺的风险甚至放弃检查，造成缺陷儿的出生。因此，寻找一种新的方法能够快速准确地进行诊断成为必然。 荧光原位杂交技术是将细胞遗传学、分子遗传学及免疫学相结合的一种新兴技术。它利用已知核酸序列作为探针，以荧光素直接标记或以非放射性物质标记后与靶DNA进行杂交，再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，最后在荧光显微镜下观察杂交信号，从而对标本待测核酸进行定量、定性及定位分析。我国于上世纪90年代末开始该技术的研究[3]。目前，随着科学技术的迅猛发展，它已广泛地运用于产前诊断的多个领域:未培养的孕中期羊水标本，早孕期的绒毛，胚胎植入前诊断(PGD)，孕妇外 周血中胎儿有核红细胞的检测，宫颈脱落滋养层细胞以及脐血的检测[4~8]。 本实验的结果显示荧光原位杂交技术分析结果同核型分析结果100%符合，结果满意。提示国产探针在对性染色体结果的分析上同羊水细胞培养相比，具有高度符合率，可信度较高，结果肯定，与国外同类产品有可比性。不足之处是由于样本量较少，并没有发现性染色体的非整倍体或单体。如能扩大样本量，该不足可能被解决。由于自主研发，国产探针具备价格优势，为其在国内推广提供可能。但是我们应该认识到实验过程还有待优化、完善的地方。主要有以下几点:?杂质处理不净，造成背景杂乱，影响读片。?细胞膜太厚，处理时没有被充分疏松，使探针不能进入胞核杂交，没有信号。?杂交成功，但荧光信号较弱，结果不稳定。?荧光信号淬灭过快，结果无法有效获取。我们发现，结果的满意获取，与实验步骤中一系列条件，如温度、作用时间和浓度等关系密切。通过反复摸索，我们对原实验的推荐条件进行了相应调整，最终获得较为满意的结果。 总结体会有五点:?胶原酶的用量和作用时间。胶原酶作用的对象是胶原组织，对细胞本身不会损伤，使用浓度在0.1~0.3 G/L，多数实验推荐使用5 ml[9]。羊水中胎儿细胞数量有限，如何最大限度的将有限的胎儿细胞制片，是制片的关键所在。其一，尽可能将细胞均匀平铺在玻片上，避免重叠。因此，操作时要不断地由试管底部吹打，力度均匀。这样既可以将聚集成团的细胞均 匀吹散，又不至于破坏细胞的完整性。其二，胶原酶的用量和消化时间应当个体化处理。经过对比，我们发现如果羊水离心后沉渣较多，可以适当将胶原酶用量由5 ml增加至7 ml，并且延长消化时间(30 min增加至40 min)，这样可使包裹在细胞外的黏液被充分消化，使细胞松散。?胃蛋白酶的作用时间。胃蛋白酶的作用是提高细胞的通透性[10]，有利于探针(外源性DNA)进入细胞核，同胞核中已经变性解链的内源性靶DNA杂交。实验中我们观察到，胞核、胞质的致密程度是影响探针打孔、杂交的重要原因。例如，孕周偏大的羊水标本，普遍存在羊水细胞老化的现象。实验中1例孕22周多的标本，采用胃蛋白酶作用10 min，杂交后未见信号显示。分析认为，可能由于细胞核皱缩，细胞质过厚，导致探针无法进入杂交。另1例孕22周多的样本，我们将胃蛋白酶的消化时间由10 min延长至12 min后，观察到细胞形态疏松，杂交后荧光信号清晰。?变性温度与时间。温度是杂交成功的重要条件。温度过高，变性过度，导致信号强弱不均;温度过低，变性不充分，导致荧光信号弱。实验推荐标本与探针的变性温度均为(73?1)?。但在实验中，这个条件获取的荧光信号较弱，提示可能变性不充分，因此，在对温度反复调整之后，得出适宜温度为:探针78 ?、标本73 ?，变性时间均为5 min，杂交后信号清晰，解决了国产探针信号弱的缺点。本实验中出现1例结果失败，分析后认为，除了上述胞核皱缩，探针打孔困难外，与变性温度设置不当也有一定关系。?pH值和低渗的时间。 低渗的目的是使细胞轻度肿胀，通透性增加。但过度则会造成细 胞破碎变形，甚至细胞核内染色质流失，探针无处作用。我们将 推荐时间由20 min调整至30 min后，裸核显示清晰。标本置于 变性液的pH值控制在7~8之间略偏碱(7.6)有利于杂交的成功。 ?荧光淬灭过快也是国产探针的另一缺陷。结果判读时，会发现 镜下可见清晰明亮的信号，但摄片保存后信号变弱。分析原因在 于荧光信号淬灭过快，因此在操作时注意避光、迅速尤为重要。 抗淬灭剂的加入也可以延缓淬灭。 综上所述，荧光原位杂交技术在未培养羊水的性染色体产前诊断 中具有高度的敏感性和特异性，结果快速、准确。实验使用国产 探针结果理想，证实其在具备价格优势的同时，实验结果同样满 意，但有荧光信号不稳定、容易淬灭等不足，通过对实验条件的 优化，可以获得同类产品的结果。相信随着实验的广泛开展，它 一定会被不断完善，最终替代国外产品为我国的产前诊断事业做 出贡献，为更多的患者带来福音。 【参考文献】 [1] Cremer T， Lundegent J， Bruckner A，et al.Detection of chromosome aberration in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with adioactive and nonradioactive in situ hybridization techiques:diagnosis of trisomy 18 with probe L.84. 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