荧光偏振法检测蛋白激酶 C 活性

荧光偏振法检测蛋白激酶 C 活性 前言 蛋白激酶 C ( PKC )家族成员对蛋白质中丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化过程对于正常调节许多生物学机制来说是非常重要的，这些过程包括膜结构的改变、受体脱敏、转录调节、细胞生长和分化以及免疫应答的调节。 PKC 在记忆、学习以及许多病理学过程中也扮演着重要角色。一些研究已经明 PKC 活性的异常可以导致癌症、发炎、病毒感染、免疫和 CNS 紊乱、心血管异常、糖尿病并发心血管疾病以及胰岛素耐受。因此，确定 PKC 抑制因子对于开发新的针对这些疾病的治疗手段是很重要的。 PanVera 已经开发了一种新的基于荧光偏振( FP )的蛋白激酶 C 分析试剂盒，它可以提供简单、灵敏、价格便宜和非放射性的用于高能量的潜在的 PKC 抑制因子的筛选。 检测原理 荧光偏振检测蛋白激酶 C 采用的是竞争反应的原理:荧光标记的磷酸化示踪物和由 PKC 反应产生的未标记磷酸化产物会与抗丝氨酸抗体相互竞争结合。在一个无磷酸化产物的反应液混合物中，当一部分荧光示踪物与抗体结合时会导致较高的偏振值。但是，在包含有磷酸化产物的反应液混合中，较少的示踪物会结合到抗体上 ( 荧光示踪物被从抗体上替代下去 ) ，发出的信号发生去偏振。因此，偏振的改变直接的与反应中的 PKC 活性相关。使用来自 PanVera 的此种试剂盒可以检测一些 PKC 活性，包括有 PKC α 、 PKC β I 、 PKC β II 、 PKC γ 、 PKC δ 、 PKC ε 以及 PKC , 。 实验方法 PanVera 的 PKC 分析方法一般要求四步 ( 参见 Figure 1) 。首先， 激酶、脂质、钙离子、镁离、荧光磷酸化示踪物、多肽底物和待测的 PKC 抑制因子 混合在一起。 第二步，把 ATP 加入到反应液中开始反应。经过孵育后，将包含有 EDTA 的终止检测液以及抗磷酸化丝氨酸的抗体 加入到液体中以终止激酶反应并启动抗体竞争结合。最后，测量荧光偏振值确定 PKC 的活性强弱。 使用的反应步骤，将七种 PKC 分别稀释七个浓度梯度，在 90 分钟内进行完全反应 ( 请参阅 Figure 2) 。在有 ATP 而无 PKC 的对照实验中，偏振值为 225mP( 此方法中最大可能的荧光偏振值 ) 。当有 ATP 存在时，测量不同 PKC 的偏振值，可以看到偏振值的降低直接与反应中 PKC 的量相关。 PKC 含量最多的反应会产生最多的未标记磷酸化产物，这最终会导致最低的偏振值。这结果表明对于大多数酶来，在 ATP 存在的情况下， 100pg 酶经过 90 分钟的孵育就可以完成 50%-80% 的检测反应。 P anVera 建议每个用户自己测量合适反应的速率 请参阅 Figure 2) :使用 PanVera 蛋白激酶 C 分析试剂盒测量七种 实验 1( PKC 的活性 在一个圆底黑色 96 孔板中稀释不同的酶，加入 PKC 反应液孵育 5 分钟后，加里面加入 ATP 启动反应。最后的反应成分是: 20 mM HEPES (pH 7.4) 、 10 mM MgCl 2 、 100 mM CaCl 2 , 0.1 mg/mL 磷酸化丝氨酸、 0.02 mg/mL 甘油二脂、 2 mM 多肽底物 (PanVera) 、 1X PKC 荧光磷酸化多肽示踪物、 50 mM 钒钠盐和 10 mM ATP 。经过 90 分钟孵育后，加入终止,检测混合液 ( 包含 EDTA 和抗磷酸化丝氨酸抗体 ) ，以终止反应并开始抗体结合的竞争反应。再进行 30 分钟的孵育，使用 测量所有的偏振值。所有的孵育都在室温进Tecan Genios Pro 行。 实验 2( 请参阅 Figure 3) :使用 PanVera 蛋白激酶 C 分析试剂盒测量 Staurosporine( 星形孢菌素 ) 的 I C 50 在第二个实验中检测了 PKC 抑制因子 Staurosporine 的 IC 50 值，共使用了六种酶，酶量可以保证完全进行反应。抑制的百分率通过不同浓度的 Staurosporine 进行。当 Staurosporine 增加时，反应的荧光偏振值也会增长，这显示 PKC 的活性在一定程度上被抑制了。 Staurosporine 的浓度最低时，偏振值最低，这表明 PKC 的活性在很大程度上 ( 或者是完全 ) 被抑制了。结果表明对于所有的 PKC 酶来说， Staurosporine 的 IC 50 值均小于 10nM ，而 PKC δ 被抑制得最多。从已发表的数据来看 PKC α 、 PKC β、 PKC γ 的 I C 50 值均为 9nM ，这 呈现出一定的相关性( 6 )。 在圆底黑色 96 孔板中，六种 PKC 酶 (15 ng PKC α 、 300 ng PKC β I 、 300 ng PKC β II 、 17 ng PKC γ 、 117 ng PKC δ 、 65 ng PKC ε ) 分别用一系列浓度的 Staurosporin (Calbiochem) 孵育 5 分钟。然后把 ATP 加入到反应液中。最后的反应条件是 ( 总体积 50ul) : 0.02 mg/mL 甘油二脂、 2 mM 多肽底物 (PanVera) 、 2X PKC 荧光多肽示踪物、 50 mM 钒钠盐、 0.02% NP40 、 1% DMSO 和 10 mM ATP 。经过 90 分钟孵育后，加入 50ul 终止,检测混合液 ( 包含 EDTA 和抗磷酸化丝氨酸抗体 ) ，以终止反应并开始抗体结合的竞争反应。再进行 30 分钟的孵育，使用 Tecan Genios Pro 测量所有的偏振值，并进行非线性回归分析。所有的孵育都在室温进行。 结果 结论 PanVera 的蛋白激酶 C 分析试剂盒是一种检测 PKC 酶活性和筛选或测试潜在的 PKC 抑制因子的有用的工具。可以同时检测一种或多种特定 PKC 的拮抗剂，也可以同时检测多种酶。 PanVera 建议用户自己依照每个抑制因子可能的作用 机制优化反应的条件。 PanVera 的 PKC 分析简单、易于使用，而且很好地适用于高能量的筛选应用。 应用 • 信号传导和药物筛选 C • 非放射性检测蛋白激酶 • 高通量筛选 • 定量测定抑制因子 IC 50 值 • 蛋白激酶 C 抑制因子筛选 使用 PanVvera 蛋白激酶 C 和偏振进行测试的主要优点 • ? 易于使用: 简单的 “ 即混即读 ” 设计。荧光偏振检测快速、均一而且可以在溶液中进行。 • ? 灵活性: 可以使用 96 孔板或者是 384 孔板。 • ? 稳定: 已终止反应可以稳定至少 18 小时。 参考文献 . 233: 305-312. 1 NISHIZUKA,Y. (1986) Science 2 NISHIZUKA,Y. (1992) Science . 258: 607-614. 3 DEKKER, L.V., and PARKER, P.J. (1994) Trends Biochem. Sc i. 19 : 73-74. 4 HU, H. (1996) 1: 438-447. Drug Disc. Today 5 PERRIN, J. (1926) Phys. Rad. 1: 390-401. 6 TAMAOKI,T., et a l. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 135: 397-402.