载脂蛋白A-I对三磷酸腺苷结合盒转运体A1的影响

载脂蛋白A-I对三磷酸腺苷结合盒转运体A1的影响 载脂蛋白A-I对三磷酸腺苷结合盒转运体 A1的影响 ? 1282?生垦痘堡生壁盘查hj望曼墼2生o』旦P2:丝(Z2墼=塑 【文章编号】1000—4718(2oo6)07—1282—07 载脂蛋白A—I对三磷酸腺苷结合盒 转运体A1的影响木 唐朝克,代小艳,杨峻浩,欧翔,任重,易光辉,王佐,刘录山,王双 (南华大学心血管病研究所,湖南衡阳421001). [摘要】目的:以THP一1巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象,观察载脂蛋白A—I对THP一1巨噬细胞源性 泡沫细胞胆固醇流出和三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCAI)的影响,从而探讨载脂蛋白A—I对动脉粥样硬化 (As)发生发展的影响.方法:用液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出,高效液相色谱分析细胞内总胆固醇,游离 胆固醇和胆固醇酯含量,运用逆转录一多聚酶链反应和Western印迹分别检测ABCA1mRNA与ABCAI蛋白的 达,用流式细胞术检测细胞平均ABCA1荧光强度.结果:载脂蛋白A—I引起THP一1巨噬细胞源性泡沫细胞总胆 固醇,游离胆固醇与胆固醇酯呈时间依赖性减少,而ABCA1蛋白质水平,细胞平均ABCA1荧光强度以及细胞内胆 固醇流出呈时间依赖性增加,但ABCA1mRNA没有明显变化.巯基蛋白酶抑制剂(1eupepfin和ALLN)增加ABCA1 蛋白质水平,而其它蛋白酶抑制剂(pepstatinA,aprotinin及phosphommiddon)不增加ABCA1蛋白质水平,蛋白体抑制 剂(1acmc~in)和溶酶体抑制剂(NH4CI)也不影响ABCA1蛋白质水平.结论:巯基蛋白酶可降解mP一1巨噬细胞 源性泡沫细胞ABCA1蛋白质,而载脂蛋白A—I可阻碍巯基蛋白酶降解ABCA1蛋白质,从而提高THP一1巨噬细胞 源性泡沫细胞ABCA1蛋白质水平,增加细胞内胆固醇流出,降低细胞内胆固醇聚积. [关键词】ATP结合匣式转运子;载脂蛋白A类;流式细胞术;胆固醇;脂蛋白类;泡沫细胞 【中圈分类号】R363【文献标识码】A EffectsofapofipoproteinA?--IonATPbindingcassettetransporterA1 degradationandcholesteroleffluxinTHP一1macrophage—derivedfoam cells' TANGChao—ke,DAIXiao—yah,YANGJun—hao,OUXiang,RENZhong,YIGuang— hui,WANGZuo.LIULu—shan.WANGShuang (InstituteofCardiovascularDisease,NanhuaUni~rsity,ttengyang421001,China) [ABSTRACT]AIM:Tostudytheeffectsofapolipoprotein(apo)A—IonATPbindingcassettetransporterA1 (ABCA1)degradationandcholesteroleflluxinTHP一1macrophage—derivedfoamoell8.METHODS:Afterexposureof theculturedTHP一1macrophage—derivedfoamceilstoapolipoproteinA—Ifordifferenttinm,cholesterolemux,ABCA1 mRNAandproteinlevelweredeterminedbyliquidscintillationcounting,reversetranscripta se—polymerasechainreaction andWesternblotting,respectively.ThemeanABCA1fluorescenceintensityonTHP一1macrophage—derivedfoamcellsWas detectedbyflowcytometIy.RESULTS:ApoA—ImarkedlyincreasedABCA1一mediatedcholesteroleflluxfromTHP一1 macrophage—derivedfoamcells.ThisWasaccompaniedhyanincreaseinthecontentofABCA1.ApoA—Ididnotalter ABCA1mRNAabundance.ThiolproteaseinhibitomincreasedthelevelofABCA1proteina ndsloweditsdecayinTHP一1 macrophage—derivedfoamceils,whereasnoneoftheproteosome— specificinhibitorlactacystin,otherproteaseinhibitom,Or thelysesemalinhibitorNH4CIshowedsucheffects.TheapoA— Imediatedcellul81"cholesterolemuxWasenhancedbythiol proteaseinhibitom.CONCLUSION:Thiolproteaseinhibitommightprovideanalternative waytoupregulateABCA1pro- tein.Thisstrategyisespeciallyappealingsinceitmaymimicthestabilizingeffectofthenatura lligandsapoA—I. [KEYWORDS]ATP— bindingsettetransporters;ApolipoproteinsA:Flowcytometry;Cholesterol;Lipoproteins; Foamcells Tangier(TD)病是由三磷酸腺苷结合盒转运体 A1(ATPbindingcassettetransporterA1,ABCA1)突 变引起,ABCA1突变也是家族性高密度脂蛋白(h油 densitylipoprotein,HDL)水平降低的原因之一.并且 【收稿日期】2004—10—12【修回日期】2004—12—02 基金项目】国家自然科学基金资助项目(No.30470720);中国博士后科学基金资助 项目(No.2005037157) Tel:0734—8281179;E—mail:tchaoke@hotmail.com 与未成熟动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)形成有 关….巨噬细胞,肝细胞和其它组织细胞中ABCA1 介导磷脂和胆固醇流出到细胞外载脂蛋白A—I (apolipoproteinA—I,apoA—I),形成新生HDL, 在血流中新生HDL进一步吸收脂质而变成成熟 HDL,最后将HDL胆固醇返回到肝脏.因此,上调 ABCA1表达对HDL形成和促进泡沫细胞胆固醇流 出起重要作用. ABCA1表达可被调控,在基础状态巨噬细胞 ABCA1蛋白质表达较少,但胆固醇负荷可明显增加 ABCA1表达.负荷乙酰化低密度脂蛋白(1owdensity lipoprotein,LDL)胆固醇酯的人单核源性巨噬细胞 其ABCA1蛋白质增加似乎与ABCA1mRNA增加不 均衡.巨噬细胞ABCA1蛋白质降解非常迅速. 这些结果说明ABCA1蛋白质降解在ABCA1功能调 节中起作用.ABCA1横接于apoA—IJ,这就产生 apoA—I调节ABCA1降解的可能性.最近研究发 现ABCA1蛋白质降解是细胞内ABCA1水平的调节 因素.因此,本研究以THP一1巨噬细胞源性泡沫 细胞为对象,观察apoA—I对THP一1巨噬细胞源 性泡沫细胞胆固醇流出和ABCA1蛋白质降解的影 响,以探讨apoA—I在As发生发展中的作用. 材料和方法 1材料与试剂 流式细胞仪(COULTEREPICSALTRAHyper— SortSystem,美国),PE公司200型高效液相色谱 仪,CPIOOMX超速离心机(TokyoJapan),FJ一2107P 液体闪烁计数器(国营二六二厂);THP一1细胞由 中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞 库提供;逆转录一多聚酶链反应试剂盒为美国Pro. mega公司产品;牛血清白蛋白(BSA),载脂蛋白A— I(apoA—I),佛波酯(phorbolmyristateacetate, PMA),乙晴,胆固醇,巯基蛋白酶抑制剂(1eupeptin 和ALLN),其它蛋白酶抑制剂(pepstatinA,aprotinin 及phosphoramiddon)和蛋白体抑制剂(1actacytin)为 Sigma公司产品;总RNA提取试剂盒(Trizo1)为上海 生物公司产品;ABCA1和GAPDH(作为内参) 引物均由上海生物工程公司合成;羊抗人ABCA1I 抗和FITC标记的兔抗羊?抗(SantaCruz公司),辣 根过氧化物酶标记兔抗羊?抗(武汉博士德公司), 其它试剂均为进口或国产分析纯. 2脂蛋白的分离,修饰及鉴定 低密度脂蛋白分离健康人血浆购自衡阳市血 站.按我们以前的方法…制备低密度脂蛋白,将 210mL血浆置超速离心机作序列超速离心.提纯的 LDL在含200I~mol/L乙二胺四乙酸的BPS液中透 析48h,BCA法定量蛋白,用PBS液调节蛋白浓度至 1g/L,并进行修饰及鉴定,过滤除菌,4?保存.高 密度脂蛋白的分离参考文献方法进行. 3细胞培养 THP一1单核细胞用含有10%小牛血清RPMI一 1640培养液,37?,5%CO培养箱中静置培养.培 养液中加青霉素和链霉素各1.0×10U/L,在每次实 验前用160nmol/L佛波酯孵育THP一1细胞24h, 使其诱导分化成巨噬细胞.巨噬细胞与50mg/L氧 化型低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein, OX—LDL)孵育48h,使细胞转变成泡沫细胞. 4胆固醇流出 胆固醇流出检测按文献描述的方法操作, THP一1巨噬细胞用0.74×10Bq/L[H]胆固醇和 50ms/LOX—LDL及含有10%小牛血清RPMI一1640 培养液共同孵育48h之后,用PBS液洗涤细胞,加 各种影响因素和含2g/L牛血清白蛋白RPMI一1640 培养液孵育细胞.用闪烁计数法检测培养液和细胞 的[H]胆固醇.胆固醇流出用培养液counts?min 除以总counts?min(培养液counts?min+细胞 counts?min),再乘以100%来表示. 5油红.染色和脂质染色的半定量分析 将细胞培养于放有消毒盖玻片的6孑L培养板 内,细胞被处理后,用PBS洗3次,50%异丙醇固定1 min,油红O染色液染色10min,苏木素染色5min, 1%HC1分色及返蓝后,水性封片剂封片.显微镜 下观察,细胞内脂质呈红色,细胞核呈蓝色,图像分 析系统收集图像并显微镜下摄像.按我们以前的方 法进行脂质染色的半定量分析即根据细胞脂滴的 面积进行细胞分类.如果细胞脂滴的面积小于细胞 核的面积记为"一";细胞脂滴的面积等于或大于细 胞核的面积记为"+"即为油红O染色细胞,每一块 玻片计数100个细胞. 6高效液相色谱分析 按我们以前描述的方法进行J.取样品1O 进行高效液相色谱分析.采用C18柱,以异丙醇:正 庚烷:乙晴为流动相进行非梯度洗脱,流速 1mL/min,柱温保持4?,216nm检测8min.以峰 面积定量胆固醇,单位为mg/g细胞蛋白;胆固醇酯 经胆固醇酯酶水解,测总胆固醇量,总胆固醇量减去 游离胆固醇量为胆固醇酯的量,以mg/g细胞蛋白为 单位. 7流式细胞术检测 按文献u方法,各组细胞经4%多聚甲醛室温 下固定30min,再用含1%小牛血清的PBS洗3遍, 每次5min,加入含1%小牛血清,1.5%ABCA1I 抗的PBS,置室温60min,含1%小牛血清的PBS洗 ,趟.I:200I"1It.,记旧缸{i'L,?机』业光眨 眦30H1inJl'k,懈化细?乜,I/c小牛IfI'l"JPll!; f先3地J.侈人洲J稍'ff,J【愉删钏胞平J!j必t血 座川,刈Jr"{f,J11Il"lFI的见帆rll机.f芝" 小吼,避t【liniiiJ川流』?till胆仅t龟洲7份 k桃If)OOOtEF川&世?榆洲 8逆转录聚合酶链反应 【?q并l?呲按l?li.t,i刺盎l弛『1{l It,取并tll圳胞I,2"逆转求11"战rI),. II取J堕转,』物Ii/Ixl』韭f?l{mtJ4<11疗 5…Iii,94t蕾IiiiiIi.60复I+1Iiniii,72f 伸Imil1.34衔耶.,献斛环72t.,f'lJJ【】 mill,ItCtI(Ijl~illlliilkI】{_I.:^1:285I67)的jI物 JrqlJ:lm5一I,IiI..^"~Gci(,I,lAn,{,(. .f,游5(,f—t.f,{^(,?{_【I^(I((:3. I'1.1t』.物KJ3176bI,fIllIfI"S引物j刊 l游5If州111'I(1f_^II,,【|【lf,,I3f,游 5rf【fi'1IlI'ft^,{71l^(,^(,3'.:II增 物K』为697lll1眨,I'r牝再取k幢物I[】txl 进fI5%琼tl,~f凝iL淋濮1匕锭包.tl,i' Jii'77g:ll';:像舒析系统"王f7-1Ji分ft【I厦 I.,III』献度.肼的比fl【代我^BCAI们 采c生 9Western印迹检测ABCA1蛋白表达 收挟』fICj?ll…巾I】^削斛缨?111液世 f罔【岫摹!解.14t:离一LL,1_】…l?际?I[醚【i(.^法 仃蚩II定J[】u崔『I人2x『凝JJ眸 缓冲陂'Illf】『热I【Jmfn以州监II脏,l JIJ6)ni】El胺凝腑世iI淋好离转lI)一 VI心.bll{伴也眦啦转移设膊确;崔fl;,f ll}怀f,封液J川2i.拨i:200llll八f抗几 ^BCAI1批4晰frJ使,ru州洗执.I2000J=『l】 人r化物m【批l?拭.{^孵莳1Ji sI洗3状…h'tI1FIJI必尤协划利^ r,t片…IlI~IITk胶像分忻系统刈J髓 片{川i."划『I的I(11i7,sI(1{】*J{嗡n世 {rltl?,I l【l统计学处理 俯所f}数幂川均龇?体f-(?)&, 州绀II;较采川,舒忻技,精 结果 1Fill"一l巨噬细胞源性泡沫化 川511IliadI?IIllJHIIII雌till胞J H订48hJI?llr拈也,设镜眦簪圳旭 浆IqfI几I'l~j滴仃.池川眦形态特|l}1 1)旧i,j川1救fl也】诗舒{gf~'lllJi2,…il,r,1岍游 离?i?i-雕情均io】?增/JirJ【川造川Ig47 均仃抖(I'<【】115).J,lititl?乜?JIil谁哳.^ 53…r1…增剑316rag/篮I【l范IJJ圳胞l1何 l1嗍聚纯.m1肾凹…I川醇之比fl_[边]j ?%【?l(2),_I勾池沐化眦 "堪尊蓝冬 茂 姥0翳 25235 21iriq5 I4955 = RI5 IIT1jii? 2FIII……"1?,I?JmihIq…lcI{)I】 【Ii.h【|rlI,?cI…it1I'1II】titbitmc—hI,III ]t~;lliJcIk?h,liliii,clIvhighII.IIll,illr|_…Ifhr'mJ.1 hJl-I-?I1i3 圄2Tt|p—I细胞内胆固醇和胆固醇酯的高效液相色谱捡 删图 2载脂蛋白A一1对THIs'一I巨噬细胞源性泡沫 细胞胆固醇的影响 I'HI'J,啪圳胞』50…/IL.DIj 肯48hl【】-?g/Ill??^14卉0h6hI!h t:ll24Ii,或/Jrl!g/i.1^24Ii,EW掷JJ? 订24I711r~17_l包.1itm疏F眦瞒."f^一 『0仃I_1~?11胞I.滴谨i-qi~,-I少.刊I2h24iii.?iJ] 地触少irhti【l包川戢讣圳,47?542?4,3i ?3263,455】44?5个i2ii24hI叶舒圳 0hII,j比较"jI)包j…胞微ilJJ!iE}也减少f( f)05)『做稚HI包【竹析IIIl'I』-慌细胞t'lif~ ~+111胞【I,I曾游离.1【刮引均tJjJ 地喊少.I2h24I川舒圳j【]『jE鞍均格笠 (丧? 1l? 285 表1apoA—I对THP—I巨啦细胞源性泡沫细胞总胆固醇,游离胆固醇和胆固醇酯 的影响 Et4JraA—I'rIIllelevelortota1.eantilenlcholesterolinIIIP—Iffl~t-rophage 一,leriv,-'1fi:umIl{mg/g x?s.n3 'P(005f】hgmul''iFBSAgr{ml}and1-n?lrldgroup 3载脂蛋白A—I对THP—l巨噬细胞源性泡沫 细胞胆固醇流出的影响 片】50Ilfl1.t}X—I1)【l孵育TI-tt'一l巨噬细胞使 其泡沫化后,』J?10mLapoA—I孵育0h,6h,12 h和24h或』川2g/l_BSA孵育24h.或两者都加 孵育24h检测细胞小i同醇流出结粜示apoA — l对THP—lL噬卸lI胞源性池沫纳胞心阎醇流fI{ 的影响依It~1hJ不同钉所小同在oh,6h,l2h和 24h时U阎醉流出分别为3.4%4】%,6.8% 75%(圈3).l2h,24h时H【!l问醇流出均明显多于 0h时(P<0.05). Fig3.Pheeffectofap,}A一【([IehoLesternleftluxFlIP一1 Ina【1rophage—delj,etjftballlells11HP—lmacmphages uuhttrr!din24一wI1plateswerl?laIH?II1wl】}10.74×10 Bq/I:'?halestemlandcholester,d—Icmdedusing50 rng/[_oxidizedI.DIinmediumnlr48I1Afterbeing ~abhed.thecellsw?im'ubaledin2%FBSme~lium withl0『I1E/1.alma—Ifl,r?Hious【imesRadk,aclivi0v leI|IsinIhemediunland?Jllye4tteslg~rPa.~sayedI}yliq— uidscintillationcounting.Pheresuhs13./-t~raditmctMtyin themedittma.pert!erttageLrrtedillln+cellIysalera— dioaetivilles.Result.~nrI-?of3intlependenlexperi? ments.ettch]~erformedintriplkate.'P(0.050h eY(}ttporBSAgroupamlc~mtroigroup 图3载脂蛋白A一1对THP一1巨噬细胞源性泡沫细胞胆 固醇流出的影响 4载脂蛋白A—I对THP一1巨噬细胞源性泡沫 细胞ABCAImRNA表达的影响 为丁探讨apoA—I是否影响THP—I臣噬细胞 源性泡沫细胞ABCA1mRNA表达.我]采用RT— PCR榆{煲iTHP一1巨噬细胞源惟泡沫细胞ABCA1 mRNA的表达.结果示经10一nIapoA—I处理 的THP一1f噬细胞源性泡沫细胞,其ABCA1mR- NA表达没打明变化,如图4所 'Oh6h12h24hBSAConlro1M APDH ABC^l l000bp 500hp Fig4EriecIolapoA—I?JnABCAImR,Axt?…?ii)in.PHP — Imaemphage—derivedft.,amtell''t'ltP—In?llm— phage—derive~lf0amcellswexposedIL,fi'esh[114-1tium PontainJrtg10rr1.apoA—lfn)Jf)h6h.12h,24It, c.rfleshmedium(t)『llaI1]2lrally日…id"^ "】r24h.nrwilhfresh州Iintoa[~mefor24h('lJnln】1). RNAwis~latedarid2P-gsamples,rtotalRNAWe1.~ Lldft,rRT—PCRResults??[~rt!St!lll3irtdeperul,:-lllex一 [】riments 图4载脂蛋白A—l对THP—l巨噬细胞源性泡沫细胞 ABCAImRNA表达的影响 5载脂蛋自A—I对THP—I巨噬细胞源性泡沫 细胞ABCAI蛋白质水平的影响 THP—l巨噬细胞源性泡沫细胞经10『1] apoA—I处理后,提取细胞总蛋rl质经9~eslet7一曰】 迹榆测,发残ABCA1蛋白质II,?计依赖增n_10 h组的面积灰度值[j其它时l『ll々ll_l『秽{厥腰值进} 比较,0h,6h,J2hl轲I24h州仆别为1.0,1.1,1.5, I.6(图5)I2和24h时ABCA1的蛋n质龠吐均IJ』J 显多于0h时(P<0.05) 流式细胞仪检测PHP—I…噬细眦源性池沫 胞平均ABCAI旋光强度.结l粜j10nlInpc】A — I时THP—lJ噬细胞源性泡沫胞平均ABCl 荧光强度的影响依时问不同彳』所0h.6 h,】211,24h时细胞平均ABCAl荧光懂虞分别为 3I.2,32.4,387,426(I习6)12l24h时细胞平 均ABCAl荧光强度均I{J】大于0h时(P<005) BSA组和对照组分别为30.9与3I4 6蛋白酶抑制剂对ABCA1蛋白质降解的影响 THP—l?噬细胞源性泡沫细胞分剧各种蛋 白酶抑制剂共同孵育2h,Western印迹椅洲rHP—l ? l286? 巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1蛋白质水平.巯基. 蛋白酶抑制剂(1eupeptin和AUJN)增加ABCA1蛋白 质水平,而其它蛋白酶抑制剂(pepstatinA,aprotinin 及phosphoramiddon)不增加ABCA1蛋白质水平,蛋 白体抑制剂(1aetaeytin)和溶酶体抑制剂(NHC1)也 不影响ABCA1蛋白质水平(图7).嚣 7蛋白酶抑制剂对TItP一1巨噬细胞源性泡沫细蚤 胞胆固醇流出的影响毒 THP一1巨噬细胞源性泡沫细胞分别与各种浓 度apoA—I,巯基蛋白酶抑制剂(AU.N50IxmoL/L). 以及AU.N+apoA—I共同孵育4h,检测细胞胆固 醇流出.结果显示Au.N和apoA—I都可增加mP 一 1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出,并且两者有 相加作用,apoA—I有浓度依赖性增加mP一1巨 噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出(图8). THP一1巨噬细胞源性泡沫细胞分别与各种蛋' 白酶抑制剂共同孵育4h,同时加10mg/Lap0A—I 一 起孵育,检测细胞胆固醇流出.结果显示巯基蛋 白酶抑制剂(1ecpeptin和ALLN)增加apoA—I介导 的胆固醇流出,而其它蛋白酶抑制剂(pepstatinA,固 aprotinin及phosphoramiddon)不增加apoA—I介导 Oh6hl2h24hBSAControl 一?? EffectofapoA—IonABCAIproteinlevelinTHP—l macrophage—derivedfoamcells.Aftervarioustimesof apoA—Iexposure.,I.HP—lmacmphage—derivedfoam cellsweresolubilizedindetergentcontainingbuffer.Pro- reinswerethenresolvedby6%SDS—p0lyacrylamidegel electrophoresis,transferredtoaPVDFmembrane,and visualizedwithastreptavidin—homeradishperoxidase ECLassay.Results-represent3independentexperiments. i?文'P<0.050hgrouporBSAgroupandcontrol group? 载脂蛋白A—I对THP—l巨噬细胞源性泡沫细胞 ABCAI蛋白质水平的影响 (F1)12-27-g1.LMD:PMT2Log(F1)时12-27-g2.LMD:PMT2Log(F1)时12-27-il.LMD:PMT2Log ABCAI-F1TCLog (F1)时12o27-j1.LMD:PMT2Log ABCAI?FITCLog (F1)时12-27-h1.LMD:.PM/'2Log ABCAI?FITCLog (F1)【D】12-27-h2.LMD:PMT2Log ABCAI-F1TCLogABCAI-Fl'IlCLogABCAI.FITCLog Fig6EffectofapoA—IonthemeanABCA1fluorescenceintensityinTHP一1macrophage—derivedfoamcells.Afterexposureto ,I.HP一1macrophage—derivedfoamcellso.ffreshmediumcontaining10mg/LapoA—Ifor0h,6h,12h,24h,orfresh mediumcontaining2eLfattyacid—freeBSA'for24h,orwithfreshmediumalonefor24h(contro1),tllemeanABCAIfluo- rescenceintensityon,I.HP一1macrophage—derivedfoamcellswagmeasu_,~byflowcytometry. 图6载脂蛋白A—I对THP一1巨噬细胞源性泡沫细胞平均ABCAl荧光强度的影响 的胆固醇流出,蛋白体抑制剂(1aetaeytin)和溶酶体 抑制剂(NHC1)也不影响apoA—I介导的胆固醇流 出(图9.巯基蛋白酶抑制剂Au.N浓度依赖性增 加THP—l巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出 (图10). 8高密度脂蛋白对ABCAI蛋白质水平的影响 THP—l巨噬细胞源性泡沫细胞与高密度脂蛋 白(30mg/L)共同孵育0h,6h,12h,24h,经West? erR印迹和流式细胞仪检测.高密度脂蛋白不影响 ABCA1蛋白质水平(图l1). 12345678 一一? Fig7EffectofproteaseinhibitorsonlevelofABCA1proteinin THP—lmacrophage—derivedfoamcells.1:10mg/L apoA—I;2:10mg/LapoA—I+50~mol/LALLN; 3:10mg/LapoA—I+500ms/Lleupeptin;4:10mg/L apoA—I+20trmol/LpepstatinA;5:10mg/LapoA — I+10trmol/Laprotinin;6:10mg/LapoA—I+ 250ms/Lphosphoramiddon;7:10mg/LapoA—I+ 5trmol/Llactacytin:8:10mg/LapoA—I+5mmol/L NHC1.元?立n:3.'P<0.05伪controlgroup. 图7蛋白酶抑制剂对THP一1巨噬细胞源性泡沫细胞AB? CAI蛋白质降解的影响 14 l2 lO 8 6 4 2 O l234567 Fig8Effectofthiolproteaseinhibitorsoncholesterol — effl~in THP—lmacrophage—derivedfoamcells.l:control group;2:2.5mg/LapoA—Igroup;3:5ms/LapoA — Igroup;4:10mg/LapoA—Igroup;5:20mg/L apoA—Igroup:6:50trmol/LAUJNgroup;7:10 mg/LapoA—I'+50trmol/LALLNgroup.?5.n= 3.'P<0.05伪controlgroup. 图8apoA—I和巯基蛋白酶抑制剂协同增加THP一1巨噬 细胞源性泡沫细胞胆固醇流出 讨论 ABCA1在胆固醇流出和HDL代谢中起重要作 用.它介导细胞内胆固醇和磷脂流出到无脂的载 脂蛋白,其活性上调可抗动脉粥样硬化.高胆固醇 血症是动脉粥样硬化发生发展的危险因素.在胰, 肝,肺,.肾上腺和胎儿组织中ABCA1表达水平最 高?引,在各种细胞株和动脉粥样硬化组织中也有 ABCA1表达.apoA—I与细胞膜上特异的位点结合 而激活ABCAI,从而促进胆固醇流出?. 本研究显示apoA—I增加细胞内胆固醇流出, 降低细胞内胆固醇聚积,引起THP一1巨噬细胞源性 ? l287? Fig9EffectofproteaseinhibitoroncholesteroleffluxinTHP— lmaerophage—derivedfoamcells.1:10mg/LapoA— I:2:10ms/LapoA—I+50trmol/LALLN;3:10 ms/LapoA—I+500mg/Lleupeptin;4:10mg/L apoA—J+20~nol/LpepstatinA:5:10ms/LapoA — I+100.mol/Laprotinin;6:10mg/LapoA—I+ 250ms/Lphosphoramiddon;7:10mg/LapoA—I+5 trmol/Llaetacytin;8:lemg/LapoA—I+5mmol/L NH-C1.?n=3.'P<0.05t塔controlgroup. 图9蛋白酶抑制剂对THP一1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固 醇流出的影响 星10 8 g6 盎4 呈2 U0 Fig10EffectofALLNoncholesteroleffluxinTHP—lmacro- phage—derivedfoamcells.?5.凡=3.'P<0.05t塔 contro1.1:10mg/LapoA—I;2:10ms/LapoA—I +100.mol/LALLN:3:10mg/LapoA—I+20 0~mol/LALLN:4:10mg/LapoA—I+30trmol/L ALLN;5:10ms/LapoA—I+加trmol/LALLN;6: 10mg/La)A—I+500.mol/LALLN. 图1O巯基蛋白酶抑制剂AU浓度依赖性增加巨噬细胞 源性泡沫细胞胆固醇流出 Oh6hl2h24h Figl1EffectofHDLonlevelofABCA1,p. roteininTHP—l macrophage—derivedfoamcells.n=3. 图11HDL对n坤一1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCAI蛋 白质水平的影响 剂泡沫细胞总胆固醇,游离胆固醇与胆固醇酯呈时 间依赖性减少,而ABCA1蛋白质水平,细胞平均 ABCA1荧光强度以及细胞内怛固醇流出呈时间依赖 性增加,但ABCA1mRNA没有明显变化.巯基蛋白 酶抑制剂(1eupeptin和ALLN)增加ABCA1蛋白质水 平,而其它蛋白酶抑制剂(pepstatinA,aprotinin及 phosphoramiddon)不增加.ABCA1蛋白质水平,蛋白 体抑制(1actacytin)和溶酶体抑制剂(NHC1)也不影 一o/0JxIl曙u一0】u笪0I1u 2llOO 盖IsIIu勺uAl —o/0一xn一oJuu一0I1u ? 1288? 响ABCA1蛋白质水平.巯基蛋白酶抑制剂(1eupep- tin和ALLN)阻碍ABCA1蛋白质的降解?引.因此, ABCA1蛋白质分解作用很可能由巯基蛋白酶介导的 途径即钙激活中性蛋白酶来完成.由于蛋白体抑制 剂(1actacytin)不影响ABCA1蛋白质水平,所以蛋白 体对ABCA1蛋白质分解作用可以被排除.NHC1 不影响ABCA1蛋白质水平,溶酶体也不大可能对 ABCA1蛋白质起分解作用.apoA—I通过阻碍AB- CA1蛋白质降解,而增加THP一1巨噬细胞源性泡 沫细胞ABCA1蛋白质水平.因此,载脂蛋白通过阻 碍ABCA1蛋白质降解途径来稳定ABCA1蛋白质并 导致THP一1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1蛋白质 水平增加.巯基蛋白酶的抑制可进一步增加ABCA1 蛋白质水平和THP一1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固 醇流出. 高密度脂蛋白对ABCA1蛋白质稳定作用非常 小.这一结果说明ABCA1主要与无脂HDL的载脂 蛋白相互作用.由于载脂蛋白与组织间液面细胞膜 脂质相互作用,所以一小部分载脂蛋白总保持游离 形式.另外,脂质转运蛋白涉及HDL中的载脂蛋白 与脂质结合或不结合.然而,很难估计哪一部分载 脂蛋白是无脂载脂蛋白,哪一部分载脂蛋白是有脂 载脂蛋白.不过,游离载脂蛋白浓度是ABCA1稳定 和HDL组装的调节因素. 在转录水平和转录后水平可调节ABCA1的表 达,ABCA1与载脂蛋白A一1相互作用是在转录后 水平调节ABCA1的表达.ABCA1促进胆固醇流出, 导致肝X受体/维甲酸类X受体(LXR/RXR)活性降 低,最终降低ABCA1转录和蛋白质水平?.相反, 本研究显示apoA—I对ABCA1蛋白质表达是正反 馈作用.这对巨噬细胞源性泡沫细胞非常重要.增 加巨噬细胞胆固醇流出是治疗动脉粥样硬化新方 法.LXR/RXR可调节控制胆固醇流出,转运和分泌 一 组基因.LXR激活剂抗动脉粥样硬化.然而 LXR/RXR也增加固醇调节元件结合蛋白1C和它的 靶基因的转录,导致脂肪肝和高甘油三酯血症.本 研究结果提示巯基蛋白酶的抑制可提供另一种途径 来上调ABCA1蛋白质水平,促进胆固醇流出,这为 抗As提供新的希望. [参考文献】 [1]唐朝克,严鹏科,杨永宗.ABCA1在巨噬细胞胆固醇流 出中的作用[J].中国病理生理杂志,2003,19(10): l427—1431. [2]RigotV,HamonY,ChambenoitO,eta1.Distinctsites onABCA1controldistinctstepsrequiredforcellularre— leaseofphespholipids[J].JLipidRes,2002,43(12): 2077—2086. [3]LangmannT,KluckenJ,ReilM,eta1.Molecularcloning ofthehumanATE—bindingcassettetransporter1 (hABC1):evidenceforsterol—dependentregulationin macmphages[J].BiochemBiophysResCommun,1999, 257(1):29—33. [4lOramJF,LawnRM,GarvinMR,eta1.ABCA1isthe cAMP—inducibleapolipoproteinreceptorthatmediates cholesterolsecretionfromacrophages[J].JBiolChem, 2000,275(44):34508—34511. [5]