[策划书]周艳葛根提取物对酪氨酸酶活性的影响

[策划书]周艳葛根提取物对酪氨酸酶活性的影响 毕 业 论 文 学生姓名 周艳 学 号 190301048 院 (系) 淮阴师范学院生物系 专 业 生物科学 题 目 葛根提取物对酪氨酸酶活性的影响 Effects of extracts from puerarina on tyrosinase activity 鄢贵龙老师 指导教师 (姓 名) (专业技术职称/学位) (姓 名) (专业技术职称/学位) 2007 年 5 月 摘 要: 本文研究了葛根不同提取物对酪氨酸酶活性的影响.结果表明:50mg/mL的葛根素对酪氨酸酶的激活作用最强，激活率为87.42%;葛根乙醇提物在浓度为50mg/mL时对酪氨酸酶的激活作用次之;而葛根水提物在浓度为50mg/mL时对酪氨酸酶的激活作用相对较弱。 关键词: 葛根提取物 酪氨酸酶 激活作用 Abstract: This article studied on different extracts from puerarina on effect of tyrosine activity. The results indicated that: the activity ratio to tyrosinase of Puerarin was 87.42%when their density was 50mg/mL. which was the same as ethanol extracts from puerarina when their density was 50mg/mL. but higher than water extracts from puerarina. Key words: extracts from puerarina tyrosinase activation 目 录 1 引言 ………………………………………………………………………… 4 2 仪器、试剂与原料 ………………………………………………………… 4 2.1 仪器 ……………………………………………………………………… 4 2.2 试剂 ……………………………………………………………………… 5 2.3 原料 ……………………………………………………………………… 5 3 方法 ………………………………………………………………………… 5 3.1 葛根水提物的制备 ……………………………………………………… 5 3.2 葛根乙醇提取物的制备 ………………………………………………… 5 3.3 酪氨酸粗酶的提取 ……………………………………………………… 5 3.4 实验方法 ………………………………………………………………… 6 4 结果 ………………………………………………………………………… 6 4.1 葛根水提物对酪氨酸活性的影响 ……………………………………… 7 4.2 葛根乙醇提取物对酪氨酸活性的影响 ………………………………… 7 4.3 葛根素对酪氨酸活性的影响 …………………………………………… 7 结论 ………………………………………………………………………………9 参考文献…………………………………………………………………………10 致谢 …………………………………………………………………………… 11 1 引言 酪氨酸酶(Tyrosinase，TYR)是皮肤黑色素生物合成的主要限速酶，其化学结构为铜结合糖蛋白。在皮肤黑色素生物合成过程中，酪氨酸羟化生成多巴，多巴氧化生成多巴醌，二羟基吲哚转化生成吲哚醌。这些反应步骤均需TYR参与，无TYR时，反应则变得非常缓 [1]慢。TYR活性与黑色素合成量呈正相关，控制其活力即可控制黑色素生成量。 色素性皮肤病可分为色素减退和色素增加两大类:分别表现为皮肤颜色变白和变黑。白癜风是最常见的色素减退性皮肤病，发病率为 0.5%,2%。发病原因复杂，而其发病机制则是由于人体皮肤和毛囊的黑素细胞内酪氨酸酶的活性减低或消失，导致黑素体生成的 [2]进行性减少或消失而引起的局限性或泛发性脱色素病变。黄褐斑是最常见的色素增加性 皮肤病。 [3]已知白癜风患者的酪氨酸酶活性降低，人们很早就认识到使用上调酪氨酸酶活性加速黑素生成的药物可提高白癜风的治疗效果。现在看来白癜风皮损区色素重获，除依赖白斑区残存的表皮黑素细胞黑素生成能力被增强外，毛囊外毛根鞘多巴染色阴性未活化的黑素细胞被激活也积极参与这一复色过程。大多数能上调酪氨酸酶活性的物质在体外还呈现 [4]出一定的促黑素细胞分化增殖能力。同样，抑制酪氨酸酶的活性可以治疗黄褐斑等色素增加性的皮肤病。 随着生活水平的提高，人们追求美的愿望更加强烈。白癜风恰恰是人体外在美的一种缺憾，因而它是严重影响人们心理健康的疾病。近年来发病率有上升趋势，但目前对白癜 [5]风的治疗仍很棘手。而中药对酪氨酸酶活性的影响，可作为治疗某些色素障碍性皮肤病 [3]的一个指标。近年来，色素性皮肤病防治的研究热点趋向于中药对酪氨酸酶的抑制或激活作用，并有望通过这一途径取得突破性的进展。 本实验采用酶活性测定法，通过测定不同浓度的葛根水提物、葛根乙醇提物及葛根素对酪氨酸酶活性的影响作用,从而筛选出对酪氨酸酶活性的激活率或抑制率较佳的葛根提取物及浓度。为中药治疗某些色素障碍性皮肤病提供一定的参考。 2 仪器、试剂与原料 2.1 仪器 FZ102型微型植物试样粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司; 100W增力电动搅拌器 江苏金坛市佳美仪器有限公司 TDL-5-A离心机 上海安亭仪器厂 GL-20G-?高速离心机 上海安亭仪器厂 SHZ-?型循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂 RE-52A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂 TE2101-L电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司 BSZ-100自动部份收集器 上海沪西分析仪器厂有限公司 HDL 组合式紫外检测仪 上海金达生化仪器有限公司 HL-2D定时数显恒流泵 上海沪西分析仪器厂有限公司 DS-1高速组织捣碎机 上海标本模型厂制造 722S可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司 2.2 试剂 L-DOPA;乙酸钠;硫酸铵;无水乙醇;冰乙酸试剂均为分析纯。 葛根素注射液(2mL;100mg;山东方明药业股份有限公司) 2.3 原料 葛根(安徽);市售马铃薯 3 方法 3.1 葛根水提物的制备 葛根经过粉碎机粉碎后，称取其粉500g，置于圆底锅内，用纯水2L边浸泡边搅拌1-2h。取上清夜于离心机中，在转速为4500转/分时离心10分钟;再取其上清夜于高速离心机在转速为9600转/分时离心10分钟;沉渣再加2L纯水重复以上步骤得上清夜，合并两次上清夜，取上清液用旋转蒸发器蒸去溶剂至浓液，将浓缩液置于干燥箱中干燥至膏状，待用。 3.2 葛根乙醇提取物的制备 称取葛根粉550g，置于圆底锅内，用60%乙醇2.2L边浸泡边搅拌1-2h。取上清液于离心机中，在转速为4500转/分时离心10分钟;再取其上清夜于高速离心机在转速为9600转/分时离心10分钟;沉渣再加2.2L 60%乙醇重复以上步骤得上清夜，合并两次上清夜;用旋转蒸发器蒸去溶剂至浓液，将浓缩液置于干燥箱中干燥至膏状，待用。 3.3 酪氨酸酶粗酶的提取 取4?保存的马铃薯去皮切碎，按照1?2(m/V)加入4?预冷的0.2mol/L乙酸钠缓冲液 [6](pH5.6)，高速匀浆2min，过滤。滤液于4?下8000r/min离心20min，取上清液加入20%饱和度的硫酸铵4? 1—2h、离心(10000r/min20min)。沉淀用0.2mol/L乙酸钠缓冲液溶解，重复在上清液中分别加入30%、40%、55%饱和度的硫酸铵分级沉淀4? 1—2h、离心(10000r/min20min)。沉淀用0.2mol/L乙酸钠缓冲液溶解，经凝胶柱收集得到酪氨酸酶粗酶液，4?保存待用。 3.4 实验方法 黑素体内黑色素的生成是以酪氨酸为基质，通过含铜的氧化酪氨酸酶的作用而形成的。合成途径为从酪氨酸经过多巴、多巴醌、直至吲哚醌为止的各种中间氧化物质聚合形 [7]成了黑色素。在酪氨酸酶反应生成黑色素的过程中，酪氨酸酶的催化作用主要发生在酪氨酸转化为多巴以及多巴转化为多巴醌这两个反应。多巴醌是一有色物质，可以用分光光 [8]度计(475nm)测定。 [8]酪氨酸酶活力测定方法参照文献，其具体操作步骤如下:先将膏状葛根水提取物用纯水稀释至浓度分别为:50 mg/mL、10 mg/mL、100 μg/mL、10μg/mL的溶液备用，然后按 本实验的反应体系在离心管中进行。总反应体系分为四组，要求添加反应体系所需试剂。 每组反应体系为6mL，其具体成分如表1。按表1准确吸取相应的试剂加入离心管中后，充分混匀，在室温孵育5-10min后，迅速转移至比色皿中，在475nm处测其吸光度。 同法分别测试葛根素在浓度分别为:50 mg/mL、40 mg/mL、30 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL的溶液及葛根乙醇提取物在浓度水提取物用纯水稀释至浓度分别为:50 mg/mL、10 mg/mL、100 μg/mL、10μg/mL的溶液。 表1 总反应体系组成成分 药品 A组 B组 C组 D组 葛根提取物V/mL 2 2 PH5.6乙酸钠缓冲液V/mL 2 4 2 L-DOPA溶液V/mL 2 2 2 2 粗酶液V/mL 2 2 利用各组吸光度，通过计算得出葛根提取物对酪氨酸酶活性的影响效果。其计算公式 [9] 如下: I% = [ (D-C)- (A-B)]/(A-B)×100 A: 未加中药样品的加酶混合液所测的吸光度A(A); B: 未加中药样品亦未加酶的混合液所测的吸光度A(B); C: 加中药样品而未加酶的混合液所测的吸光度A(C); D: 加中药样品和酶的混合液所测的吸光度A(D)。 4 结果 4.1 葛根水提物对酪氨酸活性的影响 通过上述酶活性测定法，对葛根水提取物进行测定，得出的结果如表2: 表2 葛根水提物对酪氨酸活性的激活作用 剂量 A值 B值 C值 D值 激活率% 50 mg/mL 0.117 0.044 1.796 1.896 36.99% 10 mg/mL 0.117 0.044 0.460 0.540 9.59% 100μg/mL 0.117 0.044 0.047 0.126 8.22% 10μg/mL 0.117 0.044 0.047 0.124 5.48% 由表2可知:50 mg/mL、10 mg/mL、100 μg/mL、10μg/mL的葛根水提物对酪氨酸酶 5.48%。即50 mg/mL的葛根水提物对酪氨酸酶激活率分别为:36.99%、9.59%、8.22%、 激活率较强为36.99%。10μg/mL的葛根水提物对酪氨酸酶激活率较弱为5.48%。 4.2 葛根乙醇提取物对酪氨酸活性的影响 通过上述酶活性测定法，葛根乙醇提取物对酪氨酸酶活性的影响结果如表3: 表3葛根乙醇提取物对酪氨酸活性的激活作用 剂量 A值 B值 C值 D值 激活率% 50 mg/mL 0.200 0.045 1.781 2.041 67.74% 10 mg/mL 0.200 0.045 0.545 0.744 28.39% 100μg/mL 0.200 0.045 0.049 0.226 14.19% 10μg/mL 0.200 0.045 0.051 0.224 11.61% 由表3可知:50 mg/mL、10 mg/mL、100 μg/mL、10μg/mL的葛根乙醇提取物对酪氨酸酶激活率分别为:67.74%、28.39%、14.19%、 11.61%。可见50 mg/mL葛根乙醇提取物对酪氨酸酶的激活作用比50 mg/mL葛根水提物对酪氨酸酶激活作用强。 4.3 葛根素对酪氨酸活性的影响 通过上述酶活性测定法，葛根素对酪氨酸酶活性的影响结果如表4: 由表4可知:50 mg/mL、40 mg/mL 、30 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL的葛根素对酪氨酸酶激活率分别为:87.42%、27.81%、0.00%、32.45%、29.14%。可见50 mg/mL葛根素对酪氨酸酶激活率最强为87.42% 。30 mg/mL对酪氨酸酶的激活作用不明显。由表4中葛根素对酪氨酸酶的激活率，可以推知:当葛根素溶液浓度在一定的范围内时，葛根素对酪氨酸酶的激活作用随着葛根素溶液浓度的降低而逐步减弱。当减弱到一定程度时，葛根素对酪氨酸酶的激活作用又会随葛根素浓度的降低而逐渐增强。为什么在低浓度时激活作用增强,还有待进一步的实验进行说明，其机理目前仍不清楚。 表4葛根素对酪氨酸活性的激活作用 剂量 A值 B值 C值 D值 激活率% 50 mg/mL 0.204 0.053 0.052 0.335 87.42% 27.81% 40 mg/mL 0.204 0.053 0.056 0.249 0.00% 30 mg/mL 0.204 0.053 0.113 0.264 20 mg/mL 0.204 0.053 0.104 0.304 32.45% 10 mg/mL 0.204 0.053 0.048 0.243 29.14% 结论 由上述实验可知:葛根水提物和葛根乙醇提取物对酪氨酸酶的激活作用都随其溶液浓度的降低而减弱。高浓度或低浓度的葛根素溶液对酪氨酸酶都有激活作用，但处于中间浓度的葛根素溶液对酪氨酸酶的激活作用不明显。其中50mg/mL的葛根素对酪氨酸酶的激活作用最强，激活率为87.42%。葛根乙醇提物在浓度为50mg/mL时对酪氨酸酶的激活作用次之。而葛根水提物在浓度为50mg/mL时对酪氨酸酶的激活作用相对较弱。 由此推出高浓度的葛根水提物、葛根乙醇提取物及葛根素对酪氨酸酶有较高的激活作用。可用于临床上因酪氨酸酶活性降低和酪氨酸酶减少所造成的色素缺乏性疾病、儿茶酚 [10]胺类神经递质合成障碍性疾病的治疗(如白殿风等)。 由实验结果可知:葛根的不同提取物对酪氨酸酶的激活作用不同，同种提取物的不同浓度对酪氨酸酶的激活作用也不相同。因此,在初步筛选时,选择药物的浓度对其激活酪氨酸酶的活性是十分重要的。 本实验为测定不同浓度的葛根提取物对酪氨酸酶活性的激活作用。方法快速简捷,为初步筛选治疗因酪氨酸酶活性降低和酪氨酸酶减少所造成的色素缺乏性疾病、儿茶酚胺类神经递质合成障碍性疾病(如白殿风等)的药物提供了依据。 参考文献 [1] 李洪武，朱文元. 治疗白癜风复方中药体外对蘑菇酪氨酸酶活性的作用[J].临床皮肤科杂志. 2000,29(3):133-135 [2]刘志军，欧阳恒.中药调控酪氨酸酶活性的现状分析[J].中国中医药信息杂志.2001，8(10):19-11 [3] 闫 军. 中药对酪氨酸酶活性的影响[J]. 中草药, Chinese Traditional and Herbal Drugs. 2002, 33(4):378-380 中药乙醇提取物对酪氨酸酶活性的上调作用[J]. 临床皮肤科杂志[4] 雷铁池，朱文元等.89味 1999,28 (3):147-149 [5] 崔玲，高天文等.白净冲剂合并转移因子含药血清对黑素细胞增殖和酪氨酸酶的激活作用[J].中国美容医学.2002，11(3):208-210 [6] 胡源，刘克武等. 马铃薯酪氨酸酶的性质[J]. 化学研究与应用,2005,17(1):55-57 [7]江志洁，朱育新等.黑色素形成机理的新概念及复合美白剂的应用[J].日用化学品科学,1998,(4):3-5 [8]宁 岭，魏少敏等.美白化妆品添加剂效能的实验研究[J].日用化学业,2000,(3):12-13 [9]王建华，雷 帆等.10种中药对酪氨酸酶激活作用的研究[J].中国中医药信息杂志,2000,7(4):40 [10] 陈丽凤，吴可克等. 无机阳离子对酪氨酸酶活性的上调作用[J]. 大连轻工业学院学报.2000,19(3):175-177 致谢: 感谢鄢贵龙老师的悉心指导～