【doc】中国类孟买血型FUT1和FUT2基因研究

【doc】中国类孟买血型FUT1和FUT2基因研究 中国类孟买血型FUT1和FUT2基因研究 中华医学遗传学杂志2004年1o月第21卷第5期ChinJed!et!!!!!!!!!:!!: 中国类孟买血型乃和基因研究 郭忠慧?向东?朱自严王健莲张嘉敏刘曦沈伟陈和平 【摘要】目的研究中国类孟买血型的F力和F基因构成.方法1o个血清学初步为类 孟买血型的标本来源于不同地区,ABO常规定型,吸收放散试验鉴定其红细胞表面少量A或B抗原,检测 唾液中分泌型血型物质,或通过Lewis血型间接了解其分泌状态.聚合酶链反应一限制性片段长度多态方 法进行ABO基因分型,并与血清学结果相互验证.对F力(H)和F7(SE)的编码区进行PCR产物直 接测序,了解其H及SE位点基因型及核苷酸序列组成.结果血清学和分子生物学两种方法证实1O例皆 为罕见的类孟买血型.检测到h1(nt547—552?ag),h2(nt880-882Att),h3(nt658c—t)和h4(nt35c--~t)4个 FUT1座位上的隐性基因.同时发现两种新的隐性等位基因:h—l(nt586c--~t)和h—l'2(nt328g--~a).10例 中国类孟买个体FUT2位点的研究表明,所有被研究标本的FUT2基因,都具有nt357c--~t的同义突变,其 中1例为Se,等位基因纯合子.结论H位点的无效等位基因具有较为广泛的遗传多态性.除了已经报 道的h等位基因外,在中国类孟买个体中我们检测到两种新的隐性等位基因,并检出1个Se'的类孟买个 体及Se基因的一种新的G716A单核苷酸多态性位点. 【关键词】类孟买血型;F力基因;F7基因;H缺陷型;分泌;非分泌 AnalysisonFUT1andFUT2geneof10para-BombayindividualsinChina'GUOZhong-hui? xIANG Dong,ZHUZi-yan,WANGdian-lian,zHANGJia-min,LIUxi,SHENWei,CHENHe-ping. (BloodGroupReferenceLaboratory,ShanghaiBloodCenter,ShanghaiInstituteofBloodTransfusion, Shanghai,200051P.R.China.Email:zhonghuiguo@hotmail.corn) [Abstract]ObjectiveThisisastudyontheallelecomposingofABO.FUTlandFUT2geneloci of10para-BombayindividualsinChina.MethodsTensamplescomingfromdifferentdistrictsofChina weresuspectedofpara-Bombayphenotypebyprimaryserologytests.Routineandabsorb-elutiontests wereconductedtoidentifytheirABOtype.andduplexpolymerasechainreaction— restrictionfragment lengthpolymorphism(PCR-RFLP)wasappliedtogettingtheirABOgenotype.Mostofthemwere submittedtoatestoftheirLewistypeaswel1.ThenthroughdirectDNAsequencingwithPCRproducts Q{FUT1andFUT2genes.thegenotypesoftheirHandSEgenelociwereanalyzed.ResultsItcanbe confirmedthatthe10samplesarepara-Bombay.AlloftheirABOgenotypesareconsistentwiththe serologicalabsorb— elutionresultsandthesubstancesdetectedresultsinsaliva.Sevenoutof10have recessivehomozygousgeneattheirHlocus.Eachphenotypeofhlhl(ntS47-SS2Aag),h2h2(nt880- 882Att)andh4h4(nt35tc)areascertainedin2individuals;moreover,h3h3(nt658ct)isidentified inoneindividua1.Therestarehhheterozygousindividuals:oneish3/hl;theotherishZ/h2;thelast oneishl/h2.Theh-.1(nt586c— t)allelehasapointmutationatnt586CtoT,whichleadsanonsense mutationGin(CAG)tostop(TAG).Thesecondh.2(nt328ga)hasannt328GtoAmissensemutation, whichleadsAla(GCC),wasreplacedbyThr(ACC)at110aminoacidposition.Allthe10sampleshaveSe (nt357ct)synonymousmutation.OneBm(B/O)individualwithh4h4phenotypehasaSe(nt357ct: nt385at)allele,whoseLewistypeisLe(a+b+).Moreover,theauthorsdetecteda(nt716ga) mutationintwosamples'Segene.ConclusionFourkindsofknownhalleles(hl— h4).2kindsofnovel non— functionalFUT1alleles,aSeallele,andanovelSeG716ApolymorphisminChinesepara— Bombay individualsweredetected.Atthesametime,theauthorsnoticedthatallthe10sampleshavethent357c — tmutationintheirF7gene. [Keywords]para-Bombaybloodgroup;F力gene;F7gene;Hdeficient;secretor; non—secretor -SupportedbyShanghaiMunicipalNaturalScienceFoundation(02ZB14087).theScienceFoundationofShanghai HeahhBureau(131014Y14),andtheScienceFoundationofShanghaiBloodCenter(L1—1) 基金项目t上海市自然科学基金(02ZB14087)}上海市卫生局科研基金 (131014Y14)}上海市血液中心科研基金(L1—1) 作者单位t200051上海市血液中心上海市输血研究所血型参比研究室 ?为并列第一作者 ?417? ? 论着? 中华医学遗传学杂志2004年10月第2l卷第5期Chln】MedGenet?October20,. 【.型-!. 1952年报道了第1例H基因缺陷型一孟买型 (Bombay)血型,此后一系列H基因的变异型相继被 发现.新近的分子生物学研究将H缺陷型分为两大 类:孟买型(Bombayphenotype)即H缺陷的ABO 非分泌型(基因型h/hse/se)和类盂买型(para— Bombayphenotype)即H缺陷的ABO分泌型(基因 型h/hSe)】].我们对2000~2003年本室收集到的10 例类盂买血型标本进行了较为系统的研究. l对象与方法 1.1对象l0例类盂买血型标本来源于全国各地.上 海4例.外地6例,其中既有健康献血员也有患者.外周 静脉采取抗凝血,QINGENDNAMINIBLOOD试剂 盒抽取基因组DNA,有条件的收集唾液和家系资料. 1.2方法 1.2.1血清学实验ABO常规正反定型,吸收放敬 试验检测红细胞表面的ABH抗原.使用试剂红细胞 筛选和鉴定血清中的不规则抗体,凝集抑制试验检测 唾液中血型物质.通过Lewis血型间接了廨个体的分 泌状态. 1.2.2ABO基因分型采用0lsson等报道的两 重聚合酶链反应一限制性片段长度多态(polymerase chainreaction--restrictionfragmentlengthpolymor-- phism,PCR—RFLP)方法,进行初步ABO基因分型, 该方法针对ABO基因在nt261,467,703和1096四个 位置的核苷酸变异,进行限制性内切酶酶切片段大小 的多态性分析.引物序列如下:MO一46:5一cggaattea etcgecactgcctgggtete一3{MO一57:5一egggatcca gggtggcacCCtgcca3;MO一71:5一gggeetaggctt cagttactt一3'{MO一101:5一cgggatgeecgtccgcctgcc ttgcag一3.基因分型选用生工TaqDNA聚合酶, PERKIN—ELMERGeneAmp9600System上进行热启 动PCR,10两重PCR产物用KpnI和MspI同 时消化,37?2h,1Z非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 18OV电泳1h.剥胶后置于溴乙锭染缸染色,Image MasterVDS凝胶系统拍照.通过这种PCR—RFIP方 法,可以区分ABO位点上的A*101,A*102,B及. 等位基因A*101,A*1O2两种等位基因在血清学上 没有差异,核苷酸序列上仅在nt467位存在一个错义 突变.绝大多数自人的A型属于A*1Ol,而A*102 则在包括中国人在内的黄种人中占优势.因此在 PAGE电泳中A*101和A*102的条带分布格局有 所不同. 1.2.3FU7"/(H)和FUT2(SE)基因扩增和PCR产 物测序分析选用Yip等报道的两对引物分别扩增 具有编码蛋白质功能的,蛐基因第4外显子和 ,7"2基因第2外显子,Hi7F1和Hi8R1扩增7"/ (H)基因,产物长1163bp;SeiIF1和SeelF2扩增 ,乃(Se)基因,长l1l8bp.每种引物0.5,umol/L, MgCI:2.0mmol/L甘油l0%(V/V).热启动PCR, F7和FUT2退火温度分别为60?和64~C.PCR 产物胶回收纯化后,直接正反向测序,PCR引物即为 测序引物.使用Chromas2.23软件阅读测序图谱,选 择GeneRunnerversion3.05软件拼合,比对和分析 测序结果,与GenBank中M35531(FU7"I)和 U17894(,T2)等序列进行比对'].Hi7F1(5一cat ttgctaattcgcctttectc一3)IHi8R1(5一gatcagget acateagaaagtctcc一3);SeilF1(5一CCatctCeCage taacgtgtec一3);SeelF2(5一gggaggcagagaaggaga aaagg一3). 2结果 10例类盂买血型中5例为A,3例B,2例 AB(表1)ABO基因分型结果与血清学吸收放散检 测结果吻合(图1).吸收放散试验证实红细胞表面含 有少量A和(或)B抗原,血清中存在抗A和(或)抗B 及抗H.两例Lewis血型为Le(a—b一)的个体唾液中 均检测到血型物质,证实均属于分泌型个体. 通过对F己,力基因的DNA序列分析,我们在这 几例类孟买个体中检测到hl(nt547—552&ag),h2 (nt880—882?tt),h3(nt658c—t)和h4(nt35c—t)4 个订座位上的隐性基因,同时发现2个新的隐性 等位基因:h—l(nt586c—t)和h….2(nt328g—a)(图 2a,b).前者由于nt586C突变为T,导致Gin(CAG) 突变为终止密码(TAG);而后者nt328GtoA,导致 110位Ala(GCC)被Thr(ACc)置换. 所有被研究标本的7"2基因.都具有nt357C 到T的同义突变其中一例为se,同时具有(nt357 c—t)和(nt385a—t;lle129Phe)突变(图2c),其 Lewis血型为Le(a+b+).此外,有2例在at716位存 在G到A的错义突变,导致239位氨基酸由精氨酸 圈t8倒类盂买血型标奉ABO甚囡分墅结果 Fig1ResuttofABOgenotypiagforgpara一/tomboysamplesjlA? 10Z/A*102;2lB03jA?102/Ol4tA102/BI5jAl02/A- 102l6:BOI7EA?102/B;BIA*101/A102 十学2004旦墨堂堕堕L些!三型 eGGiGclGG6l.cGcTCCGCC5GGCCGCcGG G CAG 一 - s T t A .. G 八n.11f? c^cce^AGACG6A?AGGAGG^^AccGccAclcccGGGG6A @ 目2&h等&se萼n目甜a乜?c58t娈h一】恤目.bc自?Ga~SA袖娈lhu:肆 位摹Wc:C357TH车uA3g$T?…m目音f FI~2sqe11jTrel…f…kinds0r?…【hnllele~口ndSe'allele'kcctedin1hestudyhr1~llelewithC58BIt"In……ut?nn-b: h-aIId…th【32sAmIse…n_uEn..nn.【SealldoIlonlnzygtluswithc7Ty.洲l,L?"Ia佃l1andA385r…n1uut0I1 表1i0侧擞盂买血型的m清学受丹于生物学研究结果 TableISerologyandnm【ecuhrrest]Itsof[eI1par~ombaysamples tArg)突变为【谷氨酰胺)Glc1.其中一例为纯台子 例是杂音予 3讨论 盂型(Oh)和凳盂买血刊是人群中阿种非常罕 见的稀冉血刊盂买1()h在政洲人的频率根低.只前 1/3l2081左右.但是在印度盂买附近的马哈拉施特 拉邦人中大约为117600在巾国几群中有扳少舟q 型和十日对较多的娄孟型病倒报煎,资料表删中同 台湾类盂买m型的比例大约在l/8000到l/Ioo00,中 同香港为1/Ij620,巾圆大陆尚无这曲面的报道 输血工作昔最初星从血清学结粜巾-^识盂买和类 盂买血型的,娄盂买血型曾经被描述为fIz.(】.(]. AHztA)或者BHz'Bh)以驶ABHz【AB)等.1980 年以前.人们认为盂买型个体具有hh基因.娄盂买 个体则具有常H基因.但由丁埘红细胞上H基 困表达的另外一个位点(z)为纯台隐性基田zz.敞红 细胞上不表达H抗原. 最新的观点认为买型属H敞隔的非分谴}型t) '()f.().0).苴个体红卦日施和分泌液中均悔洲不到 AB{)抗麒,类买血型即H缺陷帕分泌型(【 secfcct~T.叫…,O~ecrector).,其特点足由 一 中华医学遗传学杂志2004年10月第鲞箜塑鱼!!!:Q!!!!::!::!: 于缺乏H(F刀)基因依赖的a(1,2)糖基转移酶,红 细胞表面缺乏ABH抗原,而在唾液等分泌液中却可 以找到ABH血型物质口].这是由于唾液中的ABH 物质的分泌受另外一个基因座位SE(F)控制. F力和F是两个同源性较高的基因,都编 码a(1,2)岩藻糖基转移酶,F刀表达在红细胞系, 表皮的上皮细胞以及血管内皮细胞,而F仅限制 性表达在内胚层起源的胃肠上皮和唾液腺,而不表达 在红白细胞系中.F刀和F7"2两个基因都位于 19号染色体长臂100kb之内L9].F刀(H)基因有4 个外显子,编码蛋白的序列位于第4外显子,糖基转移 酶分子由365个氨基酸组成.F(SE)基因包含2 个外显子,第1外显子在第2外显子上游7kb,所有的 蛋白编码序列都在第2外显子中,糖基转移酶分子由 332个氨基酸残基组成L1j. 从分子角度研究孟买型和类孟买血型,则通常分 别考虑F7"1和F7"2两个不同的基因座位的等位 基因构成,结合血清学表现,即可给出比较明确的结 果.H基因变异型具有遗传异质性和基因多态性. Fn座位上的隐性基因h有很多种.如:hl:nt547— 552位缺失AG(AGAGAG—AGAG);h2:nt880,882 位缺失TT(TTT—T);h3:nt658CGC—TGC使220 精氨酸(Arg)一半胱氨酸(Cys);h4:nt35GCC— GTC使12位丙氨酸(Ala)一缬氨酸(Va1),nt980 AAC—ACC327位天冬氨酸(Asn)一苏氨酸(Thr); h5:nt460TAC—CAC154位酪氨酸(Tyr)一组氨酸 (His);h6:nt522C—A174苯丙氨酸(Phe)一亮氨酸 (Ieu)L3j.到2002年底,已经报道与红细胞上H缺陷 型有关的等位基因有26种],19种为错义突变,其中 17种是由于编码区1,2个氨基酸的替代.此外,还有 3种是无义突变,使本来具有编码能力的密码子突变 为终止密码,另有4种为移码突变,表现为1个或2个 核苷酸缺失.多数H缺陷型红细胞为某一种突变的纯 合子,也有一些为两种不同突变的杂合状态L7]. 我们在10例类孟买血型个体中检出了h1,h2,h3 和h4四种已报道的H位点的隐性基因,其中h3h3纯 合子1例,hlhl,h2h2,h4h4纯合子各2例,h1h2杂合 子1例,另外2例分别为h3/h…一和h2/h…h…一在 nt586由于C突变为T,导致196位氨基酸由CAG谷 氨酰胺(Gln)突变为TAG终止密码.糖基转移酶分子 提前终止,可能导致其酶促关键部位缺失,故突变为隐 性无效基因.hnow.z则是由于nt328位G突变为A导致 第110位氨基酸由GCC丙氨酸(Ala)突变为ACC苏 氨酸(Thr).以上两种H位点的隐性等位基因尚未见 报道. 对10例中国类孟买血型个体F(SE)的研究 表明,所有被研究标本的F基因,都具有nt357C 到T的同义突变.这与苏宇清等口对中国汉族人 F基因位点突变初步研究的结果吻合,他们的报 道中不论分泌型还是非分泌型,所有被研究的41例中 国人都有C357T同义突变.A385T点突变在中国人 中也较为常见,同时具有C357T和A385T的Se等位 基因被称为se.这种弱的分泌型等位基因se是形 成I.e(a+b+)的原因.Le(a+b+)血型在欧洲极为少 见,但在蒙古人中比例高达25].我们在10例类孟 买血型中也检出1例Se,Lewis血型为Le(a+b+). 控制Lewis血型系统的基因座IE(FU7"3)也属 FUT家族中的一员,该基因座与HAB分泌型基因座 SE之间并不连锁,但Lewis物质和HAB起源于一个 共同的前身物.两个独立的位点IE和SE相互作用决 定Iewis抗原的产生.当Le和se同时存在时,表现 Le(a—b+),当Le和se同时存在表现Ire(a+b一), 而当IE为隐性基因纯合子(1ele)时,则不论其SE座 位上的基因是显性还是隐性基因,均表现I.e(a—b 一 )[1.. 对于类孟买血型个体即H缺陷的分泌型(hh, SE),其Lewis血型表现为Le(a—b+)或者Le(a—b 一 ),而不会表现为Le(a+b一).当SE位点为Se时, 则表现为Le(a+b+).本实验中有些标本由于来源限 制,我们无法检测其分泌型血型物质时,则通过Lewis 血型间接了解其分泌状态,即是否存在Se基因. 除此之外,10例不同来源的标本中有两例在 F7"2(SE)基因位点存在G716A位的错义突变,导 致239位氨基酸由精氨酸(Arg)突变为谷氨酰胺 (Gin).其中一例为纯合子,一例是杂合子.具有该位 点突变的纯合子Le(a—b一),但唾液中含有滴度非常 高的血型物质,属分泌型个体,因此,说明该位点的突 变并未改变Se基因的岩藻糖基转移酶活性.G716A 可能只是增加了Se等位基因的多态性. 类孟买血型是人群中一种罕见的血型,其血清学 表现与经典的ABO血型有很大差异,在临床输血前 检查时常常造成定型及配血困难.对我国人群中的类 孟买血型进行从血清学到分子生物学的系统研究,可 以阐明该血型的分子基础及遗传异质性和基因多态 性.最终将为我国稀有血型患者的血型鉴定及实施安 全有效的输血治疗提供理论基础. 参考文献 1Schenkel—BrunnerH.ABOsystem.Humanbloodgroupschemical andbiochemicalbasisofantigenspecificity.2nded.NewYork: 中华医学遗传学杂志2004年1o月第21卷第5!!!!!!!!二_二一__曼 Springerwien,2000.I10—117. 2OlssonML,ChesterMA.ArapidandsimpleABOgenotype screeningmethodusinganovelB/O2versusA/O2discriminating nucleotidesubstitutionattheABOlocus.VoxSang,1995?69 242—247. 3YipSP,CheeKY,ChanPY,eta1.Moleculargeneticanalysisof para.BombayphenotypesinChinese:anovelnon—functional FUT1alleleisidentified.VoxSang.2002,83l258—262. 4LarsenRD.ErnstLK,NairRP,eta1.Molecularcloning, sequenceandexpressionofhumanGDP?L—fucose:beta—D— galactoside2-alpha—LfucosyItransferaseeDNAthatcanformthe Hbloodgroupantigen.ProcNatlAcadSciUSA,1990,87. 6674—6678. 5KellyRJ,RouquierS,GiorgiD,eta1.Sequenceandexpressionof acandidateforthehumansecretorbloodgroupalpha(1,2) fucosyItransferasegene(FUT2).Homozygosityforanenzyme— inactivatingnonsensemutationcommonlycorrelateswiththenon— secretorphenotype.JBiolChem,1995,270l4640-4649. 6YuLC,YangYH,BroadberryRE,eta1.Heterogeneityofthe ? 421? humanHbloodgroupa(1,2)fucosyItransferasegeneamongpara— Bombayindividuals.VoxSang?1997,72l36—4O? 7GeoffD.A130,HhandLewisSystems.HumanBloodGroups.2 nded.UKlBlackwell,2002.42-4710. 8Vengelen?TylerV.ABO.HandLewisbloodgroupsand structurallyrelatedantigen.TechnicalManua1.14thed.USAl AmericanAssociationofBloodBanks.2002l285—288. 9GuoZH.AdvanceonsecretorphenotypeofABObloodgroup system.SectionGenetForeignMedSci,2001,24l104—107.[郭 忠慧.ABO血型系统分泌型研究进展.国外医学遗传学分册, 2001,24l104—107.] 10SuYQ,WuGG,WeiTL,eta1.AStudyofFUT2genepoint mutationintheChineseHanpopulation.ChinJBlood Transfusion,2003,16;239.141.[苏宇清,吴国光,魏天莉,等.中 国汉族人FUT2基因点突变初步研究.中国输血杂志,2003,16; 239—241.] (收稿日期:2004—04—19) (本文编辑刘华) 遗传性舞蹈样运动一棘红细胞增多症一家系三饲 崔爱勤李扬波刘玉玺陈玉平李德让徐家立 先证者(I.)男,36岁,因发作性抽搐6年,进行性四肢 舌,不自主多动2年就诊.患者于30岁因受惊吓出现癫痫发作 和精神症状,经卡马西平等对症治疗症状缓解.34岁时,出现 不自主多动,头摇摆,走路不稳,手足舞动,吐舌,咬舌,就餐时 常常将食物吐出口外.查体:口腔,舌多处咬伤,溃疡,口中置一 木棍以防止舌咬伤.意识清楚,反应迟钝,言语含糊,语音低,除 舌不自主多动外,颅神经检查正常.四肢肌张力低,腱反射弱, 四肢有不自主舞蹈样动作,以双上肢为着,指鼻,跟膝胫试验欠 准确,步态不稳,Romberg阴性.辅助检查:血脂正常.EEG:背 景以a波为主,可见稍多中高幅0波,少量高幅正相及负相尖 波单个发放,左右不对称,不同步,以左侧为主.头颅MRI:双侧 脑室扩大,双侧尾状核萎缩.周围血涂片经瑞一姬染色后显微镜 观察,发现典型棘红细胞,计数为12,30. 家系调查(图1)本家系3人发病,其中男2人,女1人. 发病年龄31,36岁.均表现有舞蹈样运动和周围血棘红细胞 增多.追踪随访6年,先证者起病4年后,工作能力丧失,生活 不能自理,39岁时因瘢病发作窒息死亡.I.发病3年后不能 工作,目前生活部分自理.I发病2年后不能行走,不能自行 进食,生活完全不能自理.家系中其它成员目前均无症状. 讨论自1960年Levine等首先报道此病以来,欧美及日 本陆续发现该病,并对其进行了研究.本病大多于20~30岁起 作者单位:030053太原,山西医科大学第三医院神经内科(崔爱 勤,李扬波,陈玉平,徐家立),检验科(李德让);癫痛研究所(刘玉玺) I II III ? 病例报告? 图1先证者家系图 病,多数以舌,唇不自主运动,自咬症为首发症状,少数以癫痫 样发作或四肢不自主运动起病.部分患者有认知功能障碍和精 神异常,亦可累及周围神经和运动轴索,表现为肌张力降低,腱 反射减弱.周围血中发现胞浆呈不同形状突出的异常红细胞 —— 棘红细胞是本病的特征,通常超过10,50.脑MRI示 脑室扩大,双尾状核萎缩.神经病理主要特征为尾状核高度萎 缩.遗传方式多数为常染色体隐性遗传,亦有染色体显性遗传 的报道,偶有散发病例.本文一家系兄妹3人均于30岁左右起 病,出现典型的口,舌不自主多动,咬舌及四肢舞蹈样运动,伴 有瘢病发作和精神异常及肌张力降低,腱反射减弱,走路不稳 等表现.先证者及其弟MRI提示,尾状核萎缩,脑室扩大.兄妹 3人周围血涂片均出现异常的棘红细胞,符合本病特征.本病 无特殊治疗,预后较差.本文3例患者使用氟哌啶醇,安坦,安 定控制不理想,在2,4年丧失生活自理能力.其中两例瘢病发 作,使用卡马西平治疗获得满意疗效. (收稿日期:2003—12.10) (本文编辑刘华)