实验八 PCR扩增基因

实验八 PCR扩增基因 PCR扩增基因 一 原理 聚合酶链反应—PCR是一种体外基因扩增技术，是在引物和四种脱氧核苷三磷酸存在下，利用DNA 聚合酶反复作用，使微量的特定片段得以大量扩增的反应过程。 PCR所需的条件: 引物:决定扩增产物的特异性 dNTPs Taq聚合酶 2+Mg PCR反应过程: 变性 94?C 退火延伸 50-60? 72?C Tm 每三步为一个循环，每循环一次，使模板DNA拷贝数增加1倍，理论上 30讲，30个循环后，扩增产物为2拷贝 二 试剂及器材 1、试剂 (1)10× reaction buffer:500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，0.1%明胶等。 (2)MgCl溶液:25mmol/L 2 (3)dNTPs:2.5mmol/L dATP，2.5mmol/L dCTP，2.5mmol/L dGTP，2.5mmol/L dTTP。 (4)Taq酶(5U/ul) (5)DNA模板 (6)引物溶液(10umol/L):包括Forwand Primer和Reverse Primer两种。 (7) 50×TAE缓冲液:称取Tris碱242g，量取57.1ml冰醋酸及200ml0.5mol/L的EDTA溶液，用蒸馏水加至1L。 (8)1×TAE缓冲液(pH8.1):将50×TAE缓冲液用蒸馏水稀释50倍。用作 电泳缓冲液及配制琼脂糖凝胶。 (9)6×凝胶加样缓冲液(6×loading buffer):0.25%溴酚蓝，40%甘油， ddHO。 2 2、器材 PCR仪，琼脂糖凝胶电泳系统 三 操作 1、在0.2mlEppendorf管内配制25ul反应体系: 反应物 体积(ul) ddHO 18.5 2 ×PCR缓冲液 2.5 10 2.5mmol/L dNTP 0.5 25mmol/L MgCl1 2 引物 1 0.5 引物 2 0.5 模板DNA 1 Taq酶 0.5 旋涡混合器混合，短暂离心之后将样品放入PCR仪。 2、按下述程序进行扩增 (1)94?预变性4min。 (2)94?变性40s。 (3)50.5?退火40s。 (4)72?延伸40s。 (5)重复步骤(2)—(4)30次。 (6)72?延伸10min。 3、琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物(方法见实验六)。 四、PCR常见的问题及解决办法 常见的问题 解决办法 模板中蛋白质没有去除干净 保证模板的数量及 模板 模板中含有Taq酶抑制剂 质量 模板在制备过程中丢失过多 选择高质量的酶,尽 酶的活性低 量减少运输时间 假阴性 反应体系 引物设计不合理及浓度过低 合理设计引物,摸索 出最佳的引物浓度 2+2+Mg浓度过低 和Mg浓度 提高变性温度，延长 循环参数变性温度过低,时间过短 变性时间，降低退火 设置 退火温度过高 温度 2+Mg浓度过高 2+降低Mg浓度 出现非特引物设计不合理 降底酶量 异性扩增 提高退火温度 退火温度过低 带 合理设计引物 酶量过多 出现片状 模板量相对过少 增加摸板量 拖带