免疫组化

免疫组化 一、取材 剪要锋利，取材迅速，准确，不可用力揉亚组织块，避免组织收缩，自溶或损伤，组织块大小在5mm×5mm×2mm为宜。易于说明问题和固定液的穿透，取材时先准备好玻璃小瓶，倒入适量的固定液 二、固定 将剪下的标本迅速投入到固定液的小瓶中，金属的器械和剪刀不要接触固定液，用铅笔写标签，注明标本名称，固定液名称和固定时间，将标签也一同放入固定液小瓶中，不要用水笔或油笔写标签，固定的时间因固定液种类和组织块大小而异，任氏固定液需24h 三、冲洗 冲洗的目的是洗去标本中过剩的固定液，以免影响制片和染色，根据固定液的种类，选择用水或酒精冲洗，含有酒精的固定液用相同浓度的酒精浸洗数次后可进行下一步10%甲醛短时间固定的标本可不经水洗，由50%酒精开始脱水，但是固定了数月的标本必须充分水洗。 四、脱水 为使组织能够完全包埋在石蜡中，组织块经固定和冲洗后，还必须让它完全脱去水分，将组织块经过各级浓度酒精，逐步将组织内部的水分彻底替换出去，有利于组织的透明，浸蜡。 30%酒精 50%酒精 70%酒精 80%酒精 90%酒精(45min) 95%酒精 100%酒精(30min) 五、透明 (透明剂有取代酒精的作用，又有溶解石蜡的功效，组织块经过透明处理，易于石蜡浸入到组织内部，有利于包埋和切片，常用的为二甲苯，甲苯，苯，氯仿和香柏油等) 将脱水后的组织块放入100%酒精与二甲苯1:1的混合液中，10~20min后，换入纯的二甲苯液中30~40min，对光观察，组织是否透明 六、浸蜡 将已透明的组织块浸入透明剂与融化的石蜡(1:1)的混合液中30min(60?烘箱)，然后移入融好的纯石蜡中1h 七、包埋 石蜡浸透后，准备包埋框，倒入融化的石蜡，用镊子轻轻将组织块放入包埋框中，将要切的面朝下摆正位置，注意石蜡应盖过组织块，同时标签也一同放入石蜡液中，与组织块相隔一定距离摆好组织块的位置后，将包埋框轻轻放入冷水盆中，待表面冷却凝固时将包埋框整个放入水中，等蜡块完全凝固后取出 八、切片 修整蜡块，固定在木块上，组织周围留1~2mm宽的石蜡，切下的蜡带放在一张干净的纸上，切片，展片后，60?烘箱烘干 九、染色 常用苏木精和伊红，细胞核染上苏木精(碱性蓝色)，细胞质染上伊红(酸性红色) 30%酒精 50%酒精 70%酒精 80%酒精 90%酒精(45min) 95%酒精 100%酒精(30min) 透明 浸蜡 包埋 切片 二甲苯(?)脱蜡 二甲苯(?) 100%酒精和二甲苯(1:1) 100%酒精 95%酒精 80%酒精 70%酒精 50%酒精 蒸馏水 苏木精染色 (5-8min) 自来水冲洗(显微镜下观察染色效果，细胞核染色深可用HCl分色;太浅可用蒸馏水洗后放回重染) 0.1%盐酸分色数秒 蒸馏水 70%酒精 80%酒精 90%酒精 0.5%伊红几秒 95%酒精 100%酒精 100%酒精和二甲苯(1:1) 二甲苯 十、封片 从二甲苯中取出切片找到正反面，用干纱布擦净多余二甲苯 免疫组化 30%酒精 50%酒精 70%酒精 80%酒精 90%酒精(45min) 95%酒精 100%酒精(30min) 透明 浸蜡 包埋 切片 二甲苯(?)脱蜡 二甲苯(?) 100%酒精和二甲苯(1:1) 100%酒精 95%酒精 80%酒精 70%酒精 50%酒精 蒸馏水冲洗 30%HO +水22(5~10min)(1:10灭活还原酶) 蒸馏水洗3次 切片浸入0.01M枸缘酸缓冲液(pH:6.0)煮沸后断电1-2次 15~10min后 热修复抗原 1×PBS洗1~2次 5%封闭液20min室温，甩去多余液体不洗 滴加一抗4?过夜 PBS 2min 洗3次 滴加山羊抗小鼠IgG 20~37? 20 min PBS洗2min 3次 滴加SABC 20~37? 20 min PBS洗5min 3次 DBA显色(50μlA+1mlB) 苏木精轻度染色 30%酒精 50%酒精 70%酒精 80%酒精 90%酒精 95%酒精 100%酒精 100%酒精和二甲苯(1:1) 二甲苯 中性树胶 加盖片