熊果酸和齐墩果酸的抗消化系肿瘤作用

熊果酸和齐墩果酸的抗消化系肿瘤作用 摘 要 熊果酸(UA)和齐墩果酸(OA)广泛存在于蔬菜、水果和中药材中，是生物活性广而又低毒的天然化合物。体外实验证明，UA和OA通过诱导癌细胞凋亡和坏死抑制胃癌、肠癌、肝癌等消化系肿瘤细胞增殖。UA和OA还有抗诱变、抗促癌和增强机体免疫作用。因此，UA和OA有望成为临床防治消化系肿瘤的药物。 关键词 熊果酸 齐墩果酸 抗肿瘤作用 中图分类号:R979.1;R285.6 文献标识码:A 文章编号:1006-1533(2011)12-0606-06 熊果酸(ursolic acid，UA)是化学结构类似于甘草次酸(即甘草酸的苷元)的五环三萜类天然化合物，齐墩果酸(oleanolic acid，OA)是化学结构十分类似于UA的同分异构体。两者广泛存在于植物中，并像甘草酸那样具有广泛的生物活性，如保肝、抗炎、抗变态反应、抗病毒、抗菌和抗肿瘤作用[1,4]等。本文仅综述UA和OA抗消化系肿瘤的药理作用。 1 抗胃癌作用 UA浓度和时间依赖性抑制人胃癌BGC-823细胞增殖，处理12、24、36和48 h时的半数抑制浓度(IC50)分别为59、43、38和32 μM。在UA作用下，BGC-823细胞核体积变小、皱缩，其染色体呈浓染的块状和颗粒状，聚集于核周边或裂解成碎片，并出现凋亡小体，琼脂糖凝胶电泳可呈现DNA凋亡梯带。流式细胞仪分析发现，UA浓度依赖性提高细胞亚G1峰(细胞凋亡率)，G1期细胞数下降，细胞周期滞留在S期。蛋白印迹检测发现，UA浓度依赖性下调BGC-823细胞内凋亡抑制蛋白Bcl-2表达，促进线粒体释放细胞色素C，下调生存素(survivin)表达，从而激活下游的半胱天冬酶-3活性;UA也浓度依赖性激活半胱天冬酶-8活性，从而也激活下游的半胱天冬酶-3，引发癌细胞凋亡[5，6]。 UA也浓度和时间依赖性抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖，作用12、24、36和48 h时的IC50分别为58、34、28和25 μM。SGC-7901细胞漂起，变圆、肿胀或缩小，染色质浓缩、断裂，凋亡小体形成。UA也浓度依赖性提高SGC-7901细胞凋亡率，但与对BGC-823细胞不同，UA使S期细胞数下降，细胞周期滞留在G0/G1期。机制研究发现，UA浓度依赖性抑制SGC-7901细胞内环氧化酶-2(COX-2)表达，减少前列腺素E2的生物合成，进而下调Bcl-2表达，促进肿瘤细胞凋亡[7，8]。UA还可通过抑制细胞外信号调节激酶及下游的周期素D1表达，抑制人胃癌MGC-803细胞增殖[9]。 2 抗肠癌作用 日本学者1992年，给大鼠喂饲含0.02% OA饲料能轻度预防氧化偶氮甲烷诱发肠腺癌，使对照组肠腺癌74%(20/27)的发生率及平均肿瘤数1.07?0.87分别降为52%(15/29)和0.66?0.72[10]。给大鼠每周5次灌服OA、UA或OA和UA混合物共4周，都能显著降低1，2-二甲基肼诱导大鼠结肠产生异常隐窝灶(结肠癌早期)的发生率，显示有预防结肠癌发生能力[11]。给大鼠喂含0.11% UA饲料明显降低氧化偶氮甲烷诱导的启动期大鼠结肠异常隐窝灶发生率，但对促进期和进行期大鼠的异常隐窝灶发生率无显著影响。由于UA显著提高正常和氧化偶氮甲烷处理组大鼠的结肠中性鞘磷脂酶活性、轻度提高酸性鞘磷脂酶活性，推测UA是通过促进鞘磷脂水解将结肠癌防止在启动期的[12]。 用OA或UA 60 μM与人结直肠癌HCT15细胞体外培养24,72 h，死亡细胞数和细胞碎片数增加，大多数细胞死于72 h内。UA的肿瘤细胞毒作用强于OA，IC50分别为30和60 μM。 用30 μM的UA或OA处理HCT15细胞78 h，大量细胞变性，但细胞碎片罕见。用流式细胞仪分析发现，UA 30 μM或OA 60 μM处理36和72 h，HCT15细胞逐渐累积在G0/G1期，而S期细胞数相应减少，没有检测到凋亡细胞。因此，两药可能是通过阻滞细胞周期而抑制肿瘤细胞增殖的[13]。表齐墩果酸和氧代齐墩果酸也能抑制HCT15细胞增殖[14]。OA抗人结肠癌HT-29细胞增殖的IC50为161 μM，浓度?250 μM时有中度细胞毒作用，但不激活细胞凋亡蛋白(半胱天冬酶-3)，也不诱导线粒体中活性氧(起前凋亡信号作用)生成，推测主要通过使结肠癌细胞坏死产生抗癌作用的[15]。 早在1988年就测得UA抑制人结肠癌HCT-8细胞增殖的IC50为4.5 mg/L。UA选择性增强人结肠癌HT-29细胞中的碱性鞘磷脂酶活性，进而激活半胱天冬酶、诱导凋亡而抑制结肠癌细胞增殖[16]。我国研究发现，UA(10,50 μM)浓度和时间依赖性抑制HT-29细胞增殖并诱导凋亡，处理24、48和72 h时的IC50分别为26、20和18 μM。UA使癌细胞间隙增宽，胞内颗粒增多，出现空泡并漂浮于培养液，继后出现细胞核固缩断裂，核膜消失，细胞膜突起，凋亡小体形成，使细胞周期滞留在G0/G1期，S期细胞减少，并检测到亚G1峰。推测UA是通过抑制表皮生长因子受体/丝裂原激活蛋白激酶(EGFR/MAPK)通路、上调HT-29细胞内半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-9表达、下调Bcl-2和Bcl-xL表达而诱导细胞凋亡的。但由于UA也使HT-29细胞坏死并出现细胞碎片，故认为UA也通过细胞毒作用杀伤肿瘤细胞[17,19]。UA可通过抑制蛋白激酶B的磷酸化，抑制BRAF突变的人结直肠癌CO115细胞增殖并诱导凋亡[20]。 3 抗肝癌作用 体外实验发现，UA浓度和时间依赖性促进人肝细胞癌HepG2细胞和耐药株R-HepG2细胞凋亡，抑制癌细胞增殖，但对原代培养的正常小鼠肝细胞无抑制增殖作用。抑制HepG2细胞增殖的IC50为20 μM。HepG2细胞主要被滞留在G0/G1期，并伴S期细胞数减少，引起DNA断裂，产生亚二倍体，增加细胞色素C释放，增强半胱天冬酶-3的激活。也见显著抑制SV40 DNA复制的启动、拓扑异构酶I的DNA裂解和复制蛋白A的单链DNA结合活性，增强细胞周期调节因子p21 WAF1表达。UA还能激活半胱天冬酶-8，减少抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表达，但不影响前凋亡蛋白Bax和Bak表达，使多聚ADP核糖多聚酶裂解，下调环氧化酶-2蛋白和上调热休克蛋白105 mRNA表达[21,23]。Yang等[24]最近报道，UA能活化Bak，也能通过与半胱天冬酶无关的凋亡诱导因子(AIF)信号通路(促进AIF的核易位)诱导耐药株R-HepG2细胞凋亡。整体实验也显示，UA显著抑制耐药株R-HepG2细胞在裸鼠体内生长，明显对抗癌细胞损伤肝、心、脾脏。因此，UA是通过外在的和内在的两条凋亡通路引起HepG2细胞凋亡和细胞周期终止的。 UA浓度和时间依赖性显著抑制人肝细胞癌SMMC-7721细胞增殖，诱导癌细胞周期终止和凋亡。机制研究发现，UA上调凋亡蛋白p53和Bax表达及GDF15、SOD2、ATF3的mRNA表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2和fos的mRNA表达，提示UA可能是通过激活p53通路抑制SMMC-7721细胞生长和诱导凋亡的[25]。有人用正常成纤维细胞与ras癌基因转形的R6成纤维细胞或人肝细胞癌SMMC-7721细胞一起培养的实验方法发现，OA能在对正常成纤维细胞无毒浓度下显著抑制癌细胞生长，而UA无此种抑制作用。跨池(transwell)实验发现，OA的这种抗癌作用并不需要正常细胞与癌细胞直接接触。用OA处理正常成纤维细胞后的培养基进行实验发现，OA能使正常细胞分泌具有抗癌作用的抑制因子[26]。 OA和UA诱导人肝细胞癌HuH7细胞凋亡，抑制生长的IC50分别为100和75 μM。随着OA和UA浓度增加，HuH7细胞的亚G1期百分数相应提高。机制研究认为，OA和UA是通过促使线粒体中细胞色素C释放到胞液，导致半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3活化并诱导多聚ADP核糖多聚酶裂解，同时通过抑制核因子-κB活性和下调凋亡蛋白的X-连锁抑 制因子(XIAP)而诱导HuH7细胞凋亡的[27]。UA抑制小鼠肝细胞瘤H22的体内生长，也能显著提高肝癌HepS细胞的凋亡率[28]。 4 抗其它消化系肿瘤作用 UA抑制人舌鳞癌TSCCa细胞浆中核因子-κB mRNA的表达，IC50为1.25 μM[29]。 UA(20,50 μM)显著抑制人食管癌Eca-109细胞增殖，电镜下可见典型的凋亡形态和坏死形态。机制研究发现，UA的抗Eca-109细胞作用与其提高Bax和p27 kip1蛋白表达、下调Bcl-2表达和将细胞滞留在G0/G1期有关[30]。UA、OA或含UA、OA等三萜化合物的日本杏提取物与氟尿嘧啶联用对食管鳞状癌YZS-2细胞的细胞毒作用有相加或协同作用，使细胞周期滞留在G2/M期和S期并诱导凋亡。在严重免疫缺陷小鼠腹腔注射YES-2细胞制造的腹腔血性腹水食管癌模型中，此种日本杏提取物可增强氟尿嘧啶的抗癌作用，使直径大于2 mm的腹腔结节数少于单用氟尿嘧啶或日本杏提取物治疗组[31]。 5 抗诱变和抗促癌作用 女贞子中的OA和UA浓度依赖性对抗苯并芘对鼠伤寒沙门菌的诱变活性，其中UA抗诱变作用强于OA[32]。UA在上述Ames试验中也抑制黄曲霉毒素B1的诱变性[33]。小鼠外周血和骨髓微核试验表明，灌服80 mg/kg的UA、OA或OA和UA混合物都能显著降低阿霉素所致微核发生率[34]。皮下注射OA 50、75和100 mg/kg发现，OA剂量依赖性抑制乌拉坦或环磷酰胺所致微核率(染色体损伤)的明显升高[35]。UA也明显降低环磷酰胺所致微核发生率[36]。UA和OA本身无致突变作用。UA的抗基因毒作用需要预先通过细胞介导(预先与细胞一起培养)，如与特丁基过氧化氢一起同时与细胞培养，则不能阻滞HepG2细胞中的DNA氧化损伤。此外，UA还有DNA修复功能[37]。最近研究发现，UA不仅对过氧化氢引起的人结肠腺癌Caco-2细胞中的DNA损伤有保护作用，也能提高过氧化氢性DNA损伤的修复率，提示UA有抗结肠癌发生的作用[38]。 给大鼠连续6周灌服20 mg/kg UA可对抗二乙基亚硝胺诱导、苯巴比妥促进的氧化应激性肝细胞癌形成，明显降低肝组织过氧化脂质和蛋白碳酰水平，恢复组织和浆膜ATP酶活性以及糖蛋白水平，有效抑制氧化应激对大鼠肝脏的伤害[39]。 体内、外实验表明，OA和UA能抑制佛波醇酯的促癌作用，对佛波醇酯诱导Raji细胞中EB病毒早期抗体活化具有几乎与维甲酸相同的抑制作用，并使Raji细胞的存活率更高。二阶段致癌实验也发现，外涂OA或UA明显抑制佛波醇酯对二甲基苯并蒽诱导的小鼠皮肤癌的促癌作用，其中UA的作用更强些。OA和UA并不影响佛波醇酯与受体结合，但明显抑制促癌剂佛波醇酯提高小鼠皮肤鸟氨酸脱羧酶活性，引起多胺枯竭，导致生长抑制，使细胞周期滞留在G1期并出现细胞分化[33]。OA对抗佛波醇酯诱导皮肤金属硫因基因表达和无机磷掺入人宫颈癌细胞磷脂[40，41]，产生抗促癌作用。 6 增强免疫作用 OA和UA都有保护和提高宿主防御功能、增强机体抗肿瘤的能力。OA和UA不仅促进小鼠放疗后造血系统恢复，提高外周血白细胞数，刺激脾细胞增殖，增强放疗后植物血凝素诱导脾淋巴细胞母细胞化反应[42]，还能提高吞噬细胞的防御功能。OA和UA在不影响人外周血单核细胞增殖的浓度(1.25,20 mg/L)下就能刺激γ-干扰素分泌[43]。OA还通过浓度依赖性转活核因子-κB，上调小鼠巨噬细胞中的诱生型一氧化氮合成酶和肿瘤坏死因子基因表达，刺激一氧化氮和肿瘤坏死因子合成和释放。OA的上述作用在50 μM时达到坪值，浓度大于200 μM后对巨噬细胞产生毒性[44]。用UA进行上述实验也获得了相似结果[45]。此后日本学者报道，给小鼠皮肤外涂UA显著促进皮肤环氧化酶-1和环氧化酶-2以及肿瘤坏死因子-α mRNA表达。体外实验发现，UA通过激活细胞外信号调节激酶-2，触发休止的巨噬细胞释放游走抑制因子，但不提高细胞内游走抑制因子mRNA表达。UA也浓度和时间依赖性促进小鼠腹腔巨噬细胞促进白介素-1β和白介素-6以及游走抑制因子释放。给ICR品系小鼠腹腔注射UA也可提高结肠黏膜白介素-1β分泌水平和髓过氧化物酶活性。进一步研究证明，UA与巨噬细胞上的CD36结合，激活NADPH氧化酶，使活性氧生成而激活p38 MAPK(丝裂原激活的蛋白激酶)、ERK1/2(细胞外信号调节激酶1/2)和半胱天冬酶-1，诱导白介素-1β释放，同时通过ATP结合盒转运蛋白诱导白介素-1β释放。UA诱导白介素-1β释放可因不同品系小鼠巨噬细胞中CD36和NADPH氧化酶表达状态的差异而有所不同[46,49]。因此，OA和UA能在不损伤吞噬细胞的浓度下促进吞噬细胞释放白介素-1β、γ-干扰素、一氧化氮和肿瘤坏死因子等细胞因子，从而抑杀机体内的肿瘤细胞。 腹腔注射UA、OA或甘草酸都可提高小鼠白细胞数，UA和OA连续注射6 d使小鼠白细胞数达最多，增加百分率分别为91%?5%和136%?6%，而甘草酸需9 d达到最多，增加百分率为115%?18%，可见OA升高白细胞数作用最强，同时也增加骨髓细胞构成和α-酯酶阳性细胞数。将此三药与抗原一起处理动物时都可提高脾脏空斑形成细胞数和特异抗体滴度[50]。UA能对抗环磷酰胺的免疫抑制作用，提高小鼠外周血白细胞数、巨噬细胞吞噬功能和脾脏指数，促进脾淋巴细胞增殖[28]，刺激脾细胞白介素-2和γ-干扰素生成[51]。 我国学者早在上世纪80年代就对OA的促进免疫作用进行了研究。体外实验表明，OA本身无丝裂原样作用，但能增强植物血凝素、美洲商陆丝裂原、刀豆蛋白A和白介素-2等多种丝裂原对正常人及肿瘤病人淋巴细胞的增殖作用，对抗肿瘤病人抑制性T细胞在混合淋巴细胞培养中对正常人淋巴细胞增殖的抑制作用，对抗刀豆蛋白A诱导的抑制性淋巴细胞抑制异体淋巴细胞对丝裂原的增殖反应，但不影响NK细胞的功能。皮下注射OA 50和100 mg/kg可升高正常小鼠血清抗体IgG含量，但不影响溶血素抗体含量;能对抗可的松所致小鼠胸腺和脾脏萎缩。灌服OA 100 mg/(kg?d)能增强正常小鼠巨噬细胞的吞噬功能，使荷瘤小鼠低下的细胞免疫功能(迟发超敏反应)回复到正常水平。可是也有报道，灌服OA或齐酞酸钠(OA的一种前体药物)25、50和100 mg/(kg?d)并不影响小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能，但皮下注射和腹腔注射时可剂量依赖性明显提高小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能[52]。 15例经化、放疗治疗的恢复期恶性肿瘤病人口服OA胶囊40 mg、bid共1月，服药前低下的淋巴细胞转化率即刺激指数由37?24升至72?38，巨噬细胞吞噬率由原来的37%?19%升至53%?10%，但不影响恶性肿瘤病人的NK细胞功能。在一项包括152例中、晚期癌症病人的多中心、前瞻性、双盲临床试验中，103例服OA片40 mg、tid，共1,2月。结果与安慰剂对照组(49例)比较，OA组病人的免疫功能明显改善，如巨噬细胞吞噬率由37.9%提高到49.0%，E-玫瑰花结形成率由42.8%提高到48.2%，迟发超敏反应(旧结核菌素试验)也明显提高。多数病人服OA后一般状况好转，食欲增进，血红蛋白、白细胞和血小板数上升率分别为63%、75%和79%，且无明显副作用和肝、肾功能异常[53]。 诱导树突状细胞成熟是引起抗原特异性T淋巴细胞反应的关键，为开发抗癌的树突状细胞疫苗所必需。韩国Jung等[54]最近报道，UA能诱导人单核细胞衍生的树突状细胞表型和功能成熟:UA轻度提高树突状细胞表达抗原提呈的关键分子CD1a、CD80、CD83、CD86、HLA-DR和CCR7能力，浓度依赖性提高T细胞在同种混合的淋巴细胞反应中的刺激能力和向癌细胞(CCL19和CCL21)的移行能力。进一步研究发现，UA是通过诱导树突状细胞表达编码把关样受体-2和把关样受体-4的mRNA，诱生白介素-12 p70，促使辅助T细胞(Th1)极化，激活人树突状细胞功能并诱导γ-干扰素产生，从而提高机体抗癌免疫功能的。 7 结语 OA和UA抗消化系肿瘤的作用可归纳如下:1)OA主要是使癌细胞坏死，而UA使癌细胞 凋亡和坏死，抑制细胞增殖;2)抑制细胞突变，对抗化学品的促癌作用，阻碍肿瘤形成;3) 增强机体免疫功能是OA和UA的间接抗肿瘤作用机制，而OA的促进免疫作用似乎强于UA。 OA和UA广泛分布在各种蔬菜和水果之中，可见多食蔬菜和水果对防治肿瘤是十分有益的。 参考文献 [1] 张明发，沈雅琴. 甘草酸防治肝损伤药理作用的研究,J,(抗感染药学，2010，7(4): 224-229. 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