2012动物细胞工程

2012动物细胞工程 序 一 课程说明 该课程是生物技术专业的专业必修课程;分别介绍了动物细胞工程的基础知识和各种技术的原理方法，重点介绍了各种技术的应用。 课程具有较强的综合性，是培养生物技术专业的学生掌握生物高科技技术的基础。其作用就是要使生物技术专业的本科学生对动物细胞工程的研究任务、内容和目前发展方向有一个全面的了解，并掌握一定的理论知识和判断分析问题的能力。 二 学习动物细胞工程课程的意义 细胞工程与农业、医药、生物高技术产品都有着密切的关系，在解决人类面临的重大问题，促进社会和经济发展中将会发挥重要的基础作用。 三 学习动物细胞工程的作用 1 动物细胞工程是提高动物生产性能主要技术措施之一 动物细胞工程是借助物理、化学、生物等手段来更新细胞的遗传物质或通过受精卵细胞的改造而达到改造生物的遗传特性和生理功能的目的，从而有效提高动物的生产性能和产品质量。因此，动物细胞工程技术的应用，在当前提高动物生产性能方面已成为最基本、最重要的技术措施之一。 2 动物细胞工程是揭示生物奥妙的主要研究手段 近年来，随着分子生物学技术的发展，遗传物质——基因已经逐渐为人类所掌握。然而，对于基因如何调控生物特定性状的机制，以及基因本身如何受外界某些因素的调控等问题，仍需人们进行长期的探索。 对于揭示上述问题，目前普遍采取的手段就是利用现代遗传理论、动物生殖生理学和细胞工程技术，所以，细胞工程理论与技术是揭示生物奥妙的必不可少的主要研究手段。 3 动物细胞工程是新品种产生的主要技术途径 现代农牧业生产中，效益的发挥主要依靠新的优良品种的产生。在过去的研究中，新品种的产生主要通过杂交改良和遗传物质偶然突变。但是，这两种途径不但耗费时间长，而且所培育的新品种不一定完全符合人们的愿望。 伴随着现代细胞构成理论与技术的不断发展，今后动物新品种的产生主要依赖于细胞基因导入和细胞克隆技术。不管借用哪一种技术，都必须以细胞工程理论和技术为指导。 4 动物细胞工程是生物制药和生物化工产品生产的主要技术措施 利用动物细胞工程与基因工程相结合，即通过基因工程提取、合成目标基因，导入动物早期受精卵细胞，生产转基因动物，然后通过转基因动物乳腺合成分泌生物活性成分，直接 利用或提取是目前最有效的生物技术制药途径之一。 5 动物细胞工程是人类今后器官移植、修复、再生的主要技术途径 通过动物细胞工程的转基因动物技术，可以生产出免疫类型与人类一致的动物，为人类器官移植带来广阔的前景。细胞工程中的干细胞克隆及定向分化研究目前已成为人类器官克隆、病变修复、更新的主要技术途径。干细胞定向分化是利用干细胞发育的多能性在体外不同的培养基中分化为不同的组织细胞。 另外，通过细胞工程中细胞克隆和基因工程技术构建新的动物模型，有助于更好地研制新的生物药品以有效的应对人类各种疑难疾病的治疗。 6 动物细胞工程是珍稀动物保护、扩繁的主要技术手段 我国特有珍稀动物大多处于濒临灭绝的边缘。如何有效的保护扩繁这些十分珍贵的动物，满足人类需要, 动物细胞工程技术中细胞体外培养、细胞冷冻保存、体外受精、人工受精、卵细胞或体细胞同种、异种克隆、胚胎移植等手段为保护这些动物提供了一个技术平台。 7 动物细胞工程是畜产品、生物制品参与国际市场竞争的需要 我国加入WTO后，如何提高我国畜产品、医药品数量与质量呢, 第一，必须采用现代细胞工程理论与技术，不断提高动物以及现代生物制药的生产水平和产品质量，加快该领域理论与技术的研究、新产品的开发和产品质量的改进。 第二，深入研究农产品、医药品的加工技术，进一步提高畜产品、医药产品的深加工水平。所以，加入WTO后，加速动物细胞工程理论和技术在养殖业、畜产品加工和医药领域研究与应用，能够极大的促进我国产品在国际市场上的竞争能力，争取更多的出口份额。 四 动物细胞工程的主要内容 本课程的主要内容包括: 动物早期胚胎发育基础知识、胚胎移植和试管动物、动物细胞培养及细胞融合技术、单克隆抗体技术、染色体工程、细胞拆合与重组、转基因动物、干细胞克隆与定向分化技术。 本课程以细胞工程的基本原理为依据，系统的讲述了各种动物细胞工程技术的原理、应用和发展前景。尤其是对新技术的产生过程和带来的结果进行了详细的介绍，使学生对生物高科技的真正内涵有一个清楚的了解。同时也认识到生物高科技在造福人类的同时，如果对技术的运用不得当也会带来生物安全问题。 第一章 动物细胞工程简介 二十世纪五十年代以来生命科学所取得的成就:五十年代发现 DNA 分子的 双螺旋结构;六十年代创立“基因操纵子”学说;七十年代限制性内切酶技术的发明和应用;八十分子生物学技术突飞猛进的发展。 1.1 生物技术的概念 1 生物技术(Biotechnology) 又称生物工程或生物工艺学。生物技术是以生物科学的原理为基础，利用生物体系和工程学原理，按照人们设计的蓝图，改良或加工生物体，以提供商品和社会服务的综合性技术科学。生物技术是生物科学和工程技术的发展在非常精密有效的基础上结合在一起，形成的多学科综合的结果。 2 生物技术研究领域 基因工程细胞工程、发酵工程、酶工程。 生物技术发展的核心部分是基因工程和细胞工程 ※只有含有基因工程、细胞工程、发酵工程和酶工程成分的产品才能称为生物高科技产品。 1.2 动物细胞工程 1细胞工程 应用细胞生物学、发育生物学和分子生物学的理论和技术，按照人们的需要，有、大规模的培养生物组织和细胞，以获取生物及其产品。或改变细胞的遗传组成，以产生新的种或品种，为社会和人类提供服务。 2 动物细胞工程 动物细胞工程是细胞工程的一个重要组成部分，是以动物和动物细胞为实施的生物工程，包括对动物细胞的不同层次和水平上的遗传操作。 1.3 动物细胞工程的技术 1 动物组织和细胞培养技术 培养的动物细胞可作为外源基因的受体，也可用来作为生产基因工程药物的细胞载体。 发展方向: 大型化、自动化、精巧化和固定化。 2 胚胎移植技术 作用: 1 充分发挥优良母畜的繁殖潜力 2 促进家畜改良速度 3 作为胚胎操作的基础 4 长期保存冷冻胚胎，便于运输和保存冷冻资源 3 体外受精 性别选择技术 (1) 针对雄性配子体(精子)的性别选择 (2) 针对发育早期胚胎的性别选择:免疫化学法和分子探针法 免疫化学法 — 以雄性特有的抗原(H—Y)为鉴别依据 分子探针法 — 利用标记的Y染色体探针，定位Y染色体 作用:(1)培育新品种 (2)提高胚胎移植的利用价值 4细胞融合技术 细胞融合 (Cell fusion) :又称为细胞杂交(Cell hybridization)。指真核生物体细胞在体外培养条件下，用人工的方法，使两个或两个以上的细胞融合成一个双核或多核细胞的过程。 细胞融合的过程: 细胞融合的应用:细胞融合方法是遗传工程和细胞工程中的重要方法之一，通过它可以人为地改变细胞的遗传性状，从而提高生物生产有用物质的能力或赋予生物生产新物质的能力等。当前，已在医药、育种和开发能源等方面进行了尝试，并取得了可喜的成果。 (1) 用细胞融合方法生产单克隆抗体 (2) 用细胞融合方法实现远源物种之间的基因转移 (3) 用细胞融合方法培育新品种 (4) 用细胞融合方法进行基因定位 5 单克隆抗体技术 哺乳动物具有一套完整的免疫系统用以保护自身的健康。机体对自己或异己的物质的识别及一系列反应称之为免疫反应，体内的免疫系统包括体液免疫和细胞免疫两种。 免疫系统:体液免疫系统和细胞免疫系统 抗体是一种免疫球蛋白，当机体受到细菌、病毒或其它抗原攻击时，B淋巴细胞就增殖、产生对这些抗原相应的抗体。 单克隆抗体技术(monoclonal antibody technology):通常又称为杂交瘤技术(Hybridoma technology)。 克隆:由一个细胞繁殖而形成的具有相同遗传特征的细胞。 单克隆抗体:由一个抗体形成细胞大量增殖形成的克隆所产生的抗体。 B淋巴细胞能产生特异性抗体，在体外培养条件下只能存活10-20天。 骨髓瘤细胞在体外培养条件下可以大量繁殖和长期存活，但其分泌的骨髓蛋白却没有免疫性。 单克隆抗体的应用:(1)用于医学诊断 (2) 用于治疗疾病 (3) 制备各种生物活性物质 (4) 是重要的基础研究工具 6 染色体工程技术 染色体工程(chromosome engineering)是人们按照一定的设计， 有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体的技术。广义上讲，它还包括染色体内部的部分遗传操作。 (1) 人工诱导多倍体:多倍体动物具有生长速度快，成活率高和抗病能力强等特点。 (2) 人工诱导雌、雄核发育:雌、雄核发育可以产生单性种群 7 细胞拆合与重组 细胞重组(cell reconstructed)是细胞工程中将细胞融合技术与细胞核质分离技术结合，即在融合介子诱导下与完整细胞合并，重新构成胞质杂种的过程。 (1) 鱼类、两栖类的核移植 (2) 哺乳类的核移植 (3) 克隆动物 案例: 1、 美国科学家2001年11月25日宣布，他们首次成功克隆了人类胚胎。但是这些科学家同时声称，他们这样做的目的，不是为了克隆人，而是为了制造胚胎干细胞治疗多种疾病之用。 2、2001年11月3日18时05分，我国首例“胎儿上皮细胞”克隆牛“康康”在山东莱阳农学院诞生。现场公证人员公证，这是我国唯一健康存活的体细胞克隆牛。上皮细胞是高度分化的体细胞，分化程度越高，克隆越难，把它作为供核细胞尚属首例。 3克隆羊“多利”的产生过程:将动物体细胞经过抑制培养，使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞，经移植至受体，妊娠产仔。 8 转基因动物技术 借助分子生物学实验手段，将特定的目的基因从某一生物体分离出来，进行扩增和加工，再导入动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳定地整合有人工导入的外源基因的动物称转基因动物(Transgenetic Animals)。 9 动物干细胞技术 干细胞(stem cells , SC)是指每个具有生命的有机体在从其最初形式发展成为完整体的过程中，始终保留着部分未分化的原始细胞。 思考题: 1 为什么说基因工程和细胞工程是当前生物技术发展的核心, 2 动物细胞工程主要涉及哪些技术, 第二章 动物早期胚胎发育 哺乳动物胚胎在动物生产和生物医学上的应用 1、在动物生产中的应用 , 濒危动物的挽救与繁殖力的提高(提高精子活力、人工授精、超数排卵、克隆技术) , 快速扩大优质种畜群(胚胎移植、体外受精、胚胎性别鉴定) , 改造和培育动物新品种(胚胎嵌合和转基因技术) 2、在生物医学中的应用 , 生产人用珍贵药品 例如治疗人类严重贫血，将人红细胞生长因子基因注入奶牛受精卵，经培养移植，产出 可表达这种基因的医用奶牛，牛长大后，可在牛奶中提取红细胞生长因子，一头奶牛每 年产80kg左右红细胞生长因子。 , 帮助人类优生优育:试管婴儿 第一代试管婴儿:父母体内取精子和卵细胞，人工授精，形成胚胎移植入母体子宫内 第二代试管婴儿:细胞内单精子显微注射，形成胚胎后，可把早期胚胎内的细胞一个个 分离变成单个受精卵细胞。 第三代试管婴儿:加胚胎检查程序，在胚胎形成后进入母体前进行基因诊断，避免可能 出现的遗传病。现已检测出45种遗传性异常。 第四代试管婴儿:借助他人身体培育卵子，将女性卵细胞的细胞核取出，移植到一年轻、 健康的女性卵子的细胞质中，形成一个新的、优质的卵细胞，而且仍表达前一女性的遗 传特征。将新的卵子与丈夫的精子在试管中结合成受精卵。移植到第一个女性的子宫内。 生下与提供细胞浆的“第三者”毫无关系的健康孩子。 , 提供人器官移植(用猪器官)猪的心、肺、肾、肝解剖学结构与生理学都和人类的非常 相似，但需要解决排斥反应的问题。 2.1 生殖细胞 生殖细胞:多细胞生物体内能繁殖后代的细胞的总称。包括从原始生殖细胞直到最终已分化的生殖细胞。物种主要依靠生殖细胞而延续和繁衍。 增殖期:指精原或卵原细胞经过多次有丝分裂而数量不断增多的时期。 生长期:指部分精原或卵原细胞开始生长，体积增大而成为初级精母或卵母细胞时期。 成熟期:指初级精母或卵母细胞经过两次成熟分裂，形成成熟的精细胞或卵细胞的过程。 个体发育过程: 2.2 精子的发生及调节 精原细胞:是生殖的干细胞(stem cells)，经过有丝分裂增加数量， 精原细胞的有丝分裂可以是不完全的，子细胞通过细胞质间桥而彼此相连。 初级精母细胞:在进入成熟分裂前期时 DNA加倍，这是精子发生中DNA 最后的复制。 次级精母细胞:分裂间期很短，很快进行第二次成熟分裂(染色体数目不减少的一次均等分裂)而形成两个精子细胞。 精子细胞:精子细胞埋藏于支持细胞的细胞质陷窝内，在细胞质和细胞核方面都具备了分化为精子的条件。 精子细胞不具有雄配子的功能，必须经过分化(变态)过程才能成为精子。 精子:精细胞通过体积缩小，DNA固缩，尾部和顶体的形成等过程才能最终发育成为精子。 2 精子发生的调节 雄激素结合蛋白质(ABP)对睾丸激素有很大亲和力，保留雄激素在曲精细管内对精子发生作用 2.3 卵子的发生及调节 1 卵子的形成过程 卵子是人体内最大的细胞，是精子体积的100倍。卵子细胞膜外周由内向外依次是透明带、放射冠，受精时被精子头部顶体内的水解酶分解。 在动物生命周期中，卵细胞发育时期相当长，一般卵母细胞形成阶段是从胎儿诞生开始一直到性成熟排卵为止，到青春期时卵细胞才开始进行生长，以后每一个性周期后有一批新的卵母细胞继续发育，多数生长的卵母细胞，在每个周期发育未到成熟便退化;而精子发生是一个连续的过程，不中断。 2 卵子的结构 根据卵内卵黄的多少和分布，可将动物的卵子分为两类: , 少黄卵或均黄卵(isolecithal egg):含卵黄较少，分布相对来说也较均匀。如 文昌 鱼、海胆和哺乳类的卵(从极体形成的部位可判断卵子的极性) , 多黄卵(polylecithal egg):含卵黄丰富且分布不均匀的卵 端黄卵:鸟类、两栖类、鱼类、爬行类;中黄卵:昆虫、软体动物。 卵膜: , 初级卵膜—由卵细胞本身分泌，在卵巢中形成。(海胆和蛙的卵膜) , 次级卵膜—由卵巢内滤泡细胞分泌的物质形成，有的薄而柔软，有的坚韧而厚(昆 虫和鱼类的卵壳) , 三级卵膜—由输卵管或生殖器官附属部分分泌形成。如蛙卵外的胶膜(卵带)，鸟 类卵的蛋白(提供胚胎营养)，纤维膜和蛋壳(保护卵子，并使卵子在孵育期间水 分不蒸发)。 3卵细胞发生的调节 (1)无脊椎动物(昆虫)的卵细胞发生激素调控: (2)脊椎动物(两栖类)的卵细胞发生的激素调控: 哺乳类促性腺激素分为两种:1 卵泡刺激素 (FSH);2 黄体生成激素(LH)。 功能:促使滤泡生长、卵巢排卵和刺激滤泡细胞产生雌性激素。 哺乳类卵子和它周围的滤泡细胞一起发育，形成功能单位，称为滤泡(follicle)。 黄体(corpus luteum)，是内分泌腺体，分泌孕酮和少量雌性激素。 2.4 受精作用 受精:雌雄生殖细胞经过增殖、生长和成熟的发生过程以后，从各自的性腺中排出，成熟的精、卵相遇，融合而成为合子，这个过程称为受精(fertilization)。 受精过程: 1 精子的成熟和获能 哺乳动物的精子在离开精巢后，并无使卵受精的能力，它必须经过在附睾中成熟及在雌性生殖道内获能，才具有使卵受精的能力。 精子获能的步骤:A 去掉包在精子表面的附睾蛋白和精液蛋白。B 精子质膜发生变化，包括蛋白质特性的改变;磷脂的变化;渗透性的变化等。 精子获能的主要意义是使精子准备进行顶体反应以及使精子超活化，促使其通过卵子透明带。 2 卵子的排放及其机制 无论哪种方式的排卵，都与神经系统和激素有关，特别是高等脊椎动物的排卵与大脑皮层或下丘脑、垂体之间相互关系更密切，既相互联系又相互制约，形成一种正负反馈的调节机制。 排卵是极复杂的生理活动，现已知，垂体直接控制动物排卵，如果切除垂体，生理周期也完全停止。 3 精卵识别 动物的精卵相遇主要是由于大多数动物的精子能自由活动，每次排出的精子的数量也相当大(马40~200亿/次，猪200~800亿/次，羊 20~100亿/次)，以及卵子体积较大的缘故。 部分动物似乎存在类似趋化性的现象 4 顶体反应(acrosomal reaction) 顶体内含有很强的水解酶，当精子到达卵细胞的附近，精子的质膜和外顶体膜呈囊泡状脱落，释放出顶体内的水解酶，这些酶水解卵膜，使精子进入卵子。这个反应称为顶体反应。 顶体反应的作用: 1 释放顶体酶，使精子通过卵外的各种膜。 2 诱发精子赤道段和顶体后区的质膜发生生理变化，以便随后与卵质膜发生融合。 精子头部与卵膜成分接触诱发顶体反应(acrosomal reaction)。 5 皮层反应(cortical reaction) 精子一旦与卵子接触，卵子本身就开始发生一系列深刻的变化 —— 卵子的激动 在卵子激动时(精子或人工刺激下)，皮层颗粒首先于接触(或刺激)之点发生破裂，然后波及整个卵子的皮层。颗粒内含物(粘多糖)被排出，一部分与卵外的卵黄膜一起形成受精膜;另一部分留在卵子和受精膜之间的卵周隙中，吸收水分，结果使受精膜逐渐与卵子分开而举起(这是卵子受精一个重要指标)—皮层反应 皮层反应的作用: 1 组成受精膜，防止后到的精子进入(正常的多精受精的卵除外)卵子。 2 皮层颗粒排出的粘多糖会形成有粘性的透明膜物质，与卵表面紧密相连，作用是保持随后的分裂球聚集在一起。 6 原核变化及融合 受精后精子核膨大，核膜由于泡状化而破裂并分散在卵细胞质中，其中的染色质也从致密状态开始松散而成为颗粒或细丝状。泡状的核膜在分散的染色质周围集中形成许多小囊，然后相互合并组成一双层结构的核膜 — 雄原核 卵子细胞核在完成两次减数分裂后，染色体首先分散，沿分散的染色体的边缘汇集了一些小囊。它们逐渐融合形成一双层包膜，其内含染色体称为染色体泡。随后这些小泡相互接近，包膜彼此合并形成一个形状不的雌原核。此后核变圆，体积增大，内有核仁状小体。 雌雄原核移向卵的中央并相遇，核膜消失，染色体彼此混杂在一起，建立合子的染色体组 — 原核融合 父本、母本的特征遗传给后代，并完成遗传物质的重组。 DNA----受精后很快合成 RNA----卵裂开始时才合成新的 受精卵的特点 7 受精的生物学意义 受精是使配子的单倍体恢复成为合子的双倍体，其中包括父本特征的遗传和遗传重组。受精后，合子产生一系列的按一定时、空秩序，有条不紊地进行发育，最终形成一个新的个体。 受精过程不仅完成了种属的延续，与遗传密切相联;同时在个体发生的整个过程中产生的变异，通过生殖细胞将此变异遗传下去，而导致与生物的进化密切相关。 2.5 早期胚胎发育 1 卵裂 卵裂:受精卵经过多次重复分裂，形成由很多细胞组成的分裂球的过程。 经裂:受精卵的分裂面通过卵轴，从动物极到植物极与卵的赤道面垂直。 纬裂: 分裂面与赤道面平行，垂直于卵轴的分裂。 卵裂的特点:卵裂与普通细胞分裂不同，卵裂细胞不生长而是连续分裂。在合子卵裂期，细胞间期相当短，生长期几乎没有。经过卵裂，细胞质、核体积之比逐渐减小，接近于正常的体细胞。 2 囊胚 在完全卵裂的胚胎中，经数次卵裂后形成实心细胞团。此时胚胎的外形类似桑椹被称为桑椹胚(morula)。 桑椹胚随着卵裂出现充满液体的腔—囊胚腔(blastocoele).囊胚腔的体积逐渐增加，围绕囊胚腔的细胞组成上皮层—囊胚层(blastoderm)此期的胚胎称为囊胚。 3 原肠胚 囊胚继续发育、分化，形成双胚层或三胚层的原肠胚。 囊胚的一部分细胞通过不同方式迁移到囊胚内部，形成原肠。留在外面的称为外胚层(ectoderm)，迁移到里面的称内胚层(endoderm)、中胚层(mesoderm)，这种细胞迁移过程，称为原肠形成或原肠作用。 在这个时期，细胞继续分裂但略慢，略有生长，代谢旺盛，新的蛋白质开始合成，分化成不同形态和不同机能的细胞，形成各胚层和器官原基。 组织、器官、系统的分化与形成: 细胞分化(cell differentiation ):同一来源的细胞，通过细胞分裂在细胞间产生形态结构、生化特征和生理功能有稳定性差异的过程。 细胞分化是发育生物学的中心问题 时间上的分化:一个细胞在不同的发育阶段有不同的形态结构、生化特征和生理功能，如骨髓内血细胞的发生过程 空间上的分化:同一种细胞的子代细胞所处的环境位置不同，其形态结构、生化特征和生理功能也不一样，如外胚层来源的细胞可发育成表皮细胞、神经细胞等。 思考题: 1 精子发生的顺序 2 什么是顶体反应 3 皮层反应 4 早期胚胎发育经历了哪些阶段, 5 受精作用及其生物学意义 第三章 胚胎移植和试管动物 一 胚胎移植 胚胎工程又称胚胎技术(embryo technology)，是以胚胎移植为基础，以转基因动物为中心，通过人工操作胚胎，定向改变动物性状使之为人类造福的一系列生物技术的总称。 (一)胚胎移植的目的 1 发挥优良母畜的繁殖潜力 2 促进家畜改良速度 3 作为胚胎操作的基础 4 长期保存冷冻胚胎，便于运输和保存遗传资源 (二)超数排卵(superovulation) 对供体母畜，只有实现超数排卵，才能最大限度地提高其利用率。 狗: 70万个 牛:5 — 7.5万个 大鼠:26万个 1 激素的作用 对卵巢产生作用并能引起卵的成熟和排出的激素有:孕酮、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、促性腺激素释放激素(LH-RH)、雌二醇(E2)。 LH 和孕酮的急剧增加是引起排卵的直接原因 排卵后剩下的卵泡细胞转变为黄体，并分泌孕酮，抑制其它卵泡的发育故一个生殖周期内孕酮可以有两个高峰期。 各类激素和促性腺激素虽然都有其独特的生理功能，但它们都不是单独影响机体，而是相互促进相互制约的。 正常排卵过程中激素的调节作用: 诱导家畜超数排卵，都要用注射外源激素的方法，其目的是人工地使动物体内的激素水平达到阈值，从而诱发卵的成熟和排放。 除上述几种激素外，近年来常用的激素还有:前列腺素(PG)和孕马血清促性腺激素(PMSG) PG —— 是一类不饱和脂肪酸，可引起子宫强烈收缩和黄体溶解，能有效的控制动物的发情周期和排卵。 PMSG —— 是一种糖蛋白，其功能类似于FSH和LH，但半衰期较长，且作用温和，效果显著。 2 超数排卵的方法 思路:应用刺激卵泡的化合物以增高内源性FSH的水平，促进较多的卵泡发育。几天后，再结合使用LH或相似的激素刺激卵泡的最后成熟与排卵。 FSH在动物体内的半衰期比较短，必须每日注射1~2次，连续应用5天。改用半衰期较长的 PMSG 后，注射一次即可。 I FSH + 其它激素 实例1:Foote et al 1970在牛发情周期的第16~20天进行实验第一天:20mgFSH + 5mgLH;第二天:10mgFSH + 5mgLH;第三天:10mgFSH + 5mgLH;第四天:10mgFSH + 5mgLH第五天:100mgLH 结果:共注射32头牛，平均排卵21枚(范围4~55)，回收用于胚胎移植的卵为53%。 实例 2:高建明等 1995 对发情后 9~13 天的黑白花奶牛注射FSH，第1~3 天以递减法每天早晚各注射一次，每次依据牛的体重分别为 6.5~7.5mg， 第三天晚和第四天晨注射 PG 0.4mg和0.2mg。 结果:共处理43头牛， 收集胚胎276枚，头均6.42枚，可用胚胎头均4.23枚。 实例 3:日本荒木兽医诊疗所对发情后 9~14 天的奶牛注射FSH，第一天:5.5mgFSH 早晚各一次;第二天:4.4mgFSH 早晚各一次;第三天:3.3mgFSH 早晚各一次，+ 30mgPG(15+10+5);第四天:2.2mgFSH 早晚各一次。发情期当日晚、次日早输精二次 结果:采集胚胎7644枚，平均每头12.85枚，可用胚胎达65.7%，头均8.4枚。 现在比较一致的看法是 FSH 总量一定时，采用连续四天肌肉注射，每日 2 次，逐日递减的方法最为合理，总量以经产牛 45~59mg、未经产牛 20~28mg为宜，第三天注射 PG， 发情后12~14 小时受精2次，一般可获得可靠、稳定的结果。 II PMSG +其它激素: PGSM 与 PG结合使用使牛的超数排卵方法有了很大改进，在性周期的第 8~12 天注射PMSG，2天后再注射PG促使黄体溶解。一般在PG注射 48 小时后，母牛就排卵。 实例1:Foote 等(1970)在发情期第16 或17天，注射PMSG 4000~7000IU，第19、20天注射17-ß雌二醇20mg，第21天注射HCG2000IU共实验89头，平均排卵数33枚(14~104),卵的回收率为50%。 实例2:阿尔贝塔公司 1975母牛发情后第 8~14天注射PMSG 2000IU，36小时后注射PGF2α25~30mg。 结果:平均每头获卵10.4头。 实例3:王新庄 1996在母牛发情后 8~13天注射 PMSG 2000~2500IU，48小时后注射PGF2α3.6mg，排卵后12小时输精，间隔 10~12 小时再输一次 结果:共处理30头牛，头均获卵4.92枚，可用胚胎为62%。 优点:对供体刺激小，费用低，使用方便。 缺点:PMSG半衰期较长(118~123小时)，常使一些未排的大卵泡残留卵巢而分泌雌激素，从而影响回收胚胎的质量，延长了卵巢恢复时间和重复超排间隙。 通常 PMSG的剂量在1500~3000IU时，效果比较稳定。 3 影响超数排卵效果的因素: 供体母牛的年龄;供体品种的差异;激素处理的剂量;卵巢的状况 影响超数排卵的因素还有营养、季节、地域、药物质量等。因此，在某一养殖场进行胚胎移植工作时，不论是哪一种家畜，都应尽可能地参考相关文献，并进行分组实验，取得较好的效果后，再进行推广的工作，这一个环节是十分必要的。 (三) 同步发情 胚胎移植时受体与供体同步发情，处于相同的生殖生理状态，才可能使一个供体超数排卵获得的胚胎在多个受体子宫内受孕。尤其是畜牧业集约化发展，胚胎的大规模生产应用，必须使家畜同步发情才能达到预期的目的。这是胚胎移植能否成功的关键之一。 实例1:供、受体母牛发情期同步:妊娠率 91.0%;供体比受体早一天发情期:妊娠率 52.2%;供体比受体晚一天发情期:妊娠率 56.5% 实例2:供体比受体早一天发情期:妊娠率 56.8%;供、受体母牛发情期同步:妊娠率 42.6%;供体比受体晚一天发情期:妊娠率 22.7% 胚胎移入受体比供体晚发情的子宫更为合适，因为在胚胎的采集和转移过程中，减缓了胚胎发育的进程。若受体牛比供体牛早发育两天，则不可能妊娠，而晚发育两天，尚有25%的妊娠率。 (四)胚胎的采集与检查 通常在发情开始后 3~7 天时适宜向供体母牛采集受精卵(胚胎)，最迟不超过8天。随着采卵时间延长，受精卵逐渐移向子宫各部分，不易被冲出，回收率下降。 胚胎的采集回收方法:1外科手术回收法 2非手术回收法 , 外科手术回收法 优点:操作准确、冲卵液用量少，容易检卵，回收率高。 缺点:需全身麻醉，对母畜有一定的伤害，恢复时间较长。 , 非手术回收法:非手术法借助采卵器从子宫采集胚胎。 优点:非手术法采集胚胎的采卵率一般可达50%，操作技术好的可达60%~70%，而且母畜受伤害较小，可重复多次采卵，方便简单。 缺点:非手术法的采卵率较不稳定，只能采得子宫内的胚胎，对较早期胚胎不能用此方法，对体形较小的家畜也不适合采用这种采卵方法。 并不是所有回收的胚胎都能用于移植，有的胚胎不会再发育，或者移植后不能着床。 第一，受精卵本身质量问题，受精前卵或精子的质量存在遗传缺陷。 第二，用药物促使多个卵泡的成熟和同时排卵，可能使某些卵并未发育到完全成熟的程度即被排出，这种卵或者不能受精，或者停止于早期发育阶段。 第三，在采集时胚胎可能受到损伤。 胚胎的检查:条件:无菌、37度，实体镜下观察。 正常胚胎:外观饱满、透明带完整，卵间隙小、卵裂球大小均匀、界限清晰、细胞质均匀，无明显颗粒状物质。 不正常胚胎:外观不圆满、透明带变形，卵间隙大、卵裂球不清，细胞质浑浊、有破碎的块状物。 (五)移植胚胎 胚胎移植方法与胚胎采集方法相似 , 手术法: 移植原则:移植胚胎的部位与正常胚胎发育的部位应一致。 手术移植法比采卵容易，损伤小，而且受体不象供体一样是优良母畜，即使有些损伤，也不会造成大的浪费。 , 非手术法 牛的非手术法只能移植5日龄以上的胚胎。 二 试管动物 试管动物是指利用精、卵体外受精、胚胎体外培养和移植获得的各种动物，又称体外受精动物。 试管动物的获得与前面所讲的胚胎移植所获得的动物最主要的不同是试管动物从供体获得精子和卵子，经过成熟培养，在体外人工条件下受精，并经过一段早期发育，再将胚胎移植入受体的子宫内。 试管动物技术包括:1 精子的采集与体外获能处理2 卵子的回收及成熟培养3 体外受精4 受精卵的体外发育5 试管胚胎的移植 1 精子的采集与体外获能处理 无论是体内还是体外受精，精子和卵子都必须是成熟的。所谓成熟，就是指在精、卵相遇时能完成受精和进行正常的胚胎发育。 可使精子体外获能的体液:卵泡液、输卵管分泌物、血清、房水等。 可使精子体外获能的培养条件: pH、Ca2+ 等。 目前认为:Na+ 有助于去除去能因子;Ca2+ 可诱发顶体反应;氨基葡聚糖可促使顶体酶原转变为顶体酶并诱发顶体反应;肝素可激活顶体酶并调节一磷酸腺苷活性 2 卵子的回收及成熟培养 I 卵细胞的采集方法: A 回收体内成熟的卵 B 从屠宰的家畜卵巢中采集 C 用腹腔镜取卵 D 超声波监视穿刺法取卵 B、C、D 法从卵巢中采集的卵母细胞都是未成熟的，不能直接用于受精。因此，首先要解决的问题是未成熟卵母细胞的体外成熟培养。 II 卵母细胞的体外成熟培养 从卵巢中采集到的卵母细胞，外面有多层卵丘细胞包围，故称为卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte comples, COC)。采集到的COC 大约只有1/3可以使用。 细胞体外发育率最低，而来自6~8mm卵泡中的卵母细胞体外发育率最高。 III 卵母细胞体外成熟的方法 不论哪种动物，COC的初期质量是决定卵母细胞成熟能力和以后受精能力的重要因素。因此，应从足够大的卵泡中收集COC，在形态上应为卵质均匀、透明带不变形、有多层致密而完整的卵丘细胞包裹。 卵母细胞培养液:BMOC-3、PBI、Ham`s-F10 、Ham`s-F12 、TCM-199、Tyrod`s液等。 培养液主要成分包括:氨基酸、水溶性纤维素、无机离子、大分子营养物质、激素、能量物质。 血清是主要的大分子物质的来源，所以一般培养液中加入血清是必不可少的，可用同种也可以用异种血清。血清中提供了各种生长因子和细胞因子、激素和其它的未知成分。 牛卵母细胞体外成熟培养最常用的方法:以TCM-199 作为基础培养液，添加FCS、及激素(LH、FSH和E2)。另外，添加颗粒细胞、输卵管单层细胞、输卵管细胞上清液甚至体细胞，都有助于提高卵母细胞的成熟率，并影响到受精率和早期胚胎发育。添加排卵前后的牛卵泡液可以获得添加激素的同样效果。 猪卵母细胞体外成熟培养最常用的方法:TCM-199中添加猪血清或FCS，激素以添加PMSG和卵泡液(PFF)为主。 羊卵母细胞体外成熟培养最常用的方法:TCM-199中添加HCG和E2，添加发情羊血清(EGS)的结果好于FCS。 卵母细胞体外培养对环境的要求: 温度:牛 35 ~ 40?均可使卵成熟，37 ~ 39?卵发育最好 猪 39 ~ 39.5? pH值:7.7 渗透压:330m Osm/kg CO2 :5%CO2+95%空气， 5%CO2+5%O2+90% 湿度:95% ~ 100% 水:三蒸水或纯水 3 体外受精 成熟的卵母细胞和获能的精子需要在一个合适的体外环境下共同培养一段时间，才能完成受精。目前受精成功的标志至少是看受精卵是否可以发育至囊胚阶段。 提供受精条件的基础培养液通常有:TCN-199、 TALP、BO、BMOC-3等 加入:牛血清(FCS) —— 载体蛋白 葡萄糖或丙酮酸 —— 能量 也有加入氨基酸、嘌呤碱、嘧啶碱、维生素以及血清或血清白蛋白组成复合培养液。 长期以来，多精受精一直是体外受精的一个难点。尤其是随着体外受精率的提高，多精受精率也相应增高，从而制约了正常受精的比例。 正常情况下，卵子只允许一个精子进入，其机制是当一个精子与卵相遇时，卵的静息膜电位迅速去极化，这是快速但不完全的阻止多精受精;紧接着卵膜下的皮质颗粒破裂，形成受精膜，这是完全地阻止多精受精。 在体外受精时发生较高比例的多精受精现象的因素很复杂，有些影响因子至今尚不十分清楚。一般说来，还是与精子的获能和卵母细胞的完全成熟有关。 精子获能及卵母细胞体外成熟培养时间、精子密度、精-卵共同培养时间、培养液的pH和离子强度等都会影响多精受精。 实例: Cheng 等 1986 还发现，在受精率相同的情况下，pH7.4时，多精受精率最低。 提高体外受精的辅助技术:透明带技术;透明带下受精技术;卵内注射精子技术 4 受精卵的体外培养 在目前的研究水平，人类还不能在体外模拟出子宫的环境供胚胎继续发育，因此，胚胎移植的最晚时期是发育至胚泡期。 Bowman等(1970)发现了体外培养的哺乳动物早期胚胎存在着发育阻滞(developwentblock)现象。各种动物胚胎发育阻滞出现在不同胚胎发育阶段。 胚胎发育阻滞期正好是母体—胚胎基因过度期，既由卵母细胞储存的遗传信息控制胚胎发育过度到受精后胚胎基因的启动阶段。 发育阻滞的原因:发育阻滞可能是因为胚胎基因激活时引起细胞内过氧化氢以及其它自由基水平升高，造成有丝分裂不能正常进行Nasr-esfahani, 1990)。在体外培养条件下，如果培养环境中不能消除累计的活性氧，则可能通过对类脂物和蛋白质的过度氧化反应而危害细胞，导致发育阻断。 克服阻滞现象的方法: 1 改进培养液成分和改善培养条件 2 利用体细胞或体细胞条件液共同培养，以提供发育所需的物质条件。 , 改进培养液成分和改善培养条件 I 加入生长因子 II 加入能量物质 III 加入无机盐及调节渗透压 , 与体细胞或体细胞条件培养液共培养 胚胎在添加体细胞的培养液中共培养或者在体细胞条件培养液中培养对克服发育阻滞，提高发育到囊胚的比率有明显的效果。 机理: , 能够提供生长促进因子(包括已知的和未知的) , 能去除培养液中的抑制成分 , 兼有上述两项作用 5 胚胎移植 通常移植的最适宜时期是发育到8-细胞以上的胚胎，可直接移植到子宫角前端。用非手术法移植时期用晚期桑椹胚或早期囊胚的较多。 试管动物的产生过程: 三 生殖细胞与胚胎的冷冻保存 冷冻保存技术，解决了家畜繁育产业化的问题。因为只有冷冻保存技术的成功，人工受精技术，胚胎移植技术和试管动物技术才能不受环境、地域、时间的限制广泛地应用在生产实践中。 目前，世界各国建立了许多各种动物和人类的精液库和胚胎库，正在生产、科研和服务人类的广大领域中发挥重要作用。 I 精液冷冻保存技术 1原理: 通过降低或抑制精子新陈代谢程度达到延长精子在体外寿命的目的。 为了保证冷冻精子在解冻后仍保持较高的活力，必须克服冷冻 — 解冻过程对精子的伤害。 2 冷冻方法 精子产生致死性冷冻伤害的危险温区是 0 ~ -60?，因此，精子冷冻时要以尽快的降温速度通过危险区，才能保证解冻后精子的存活率。 冷冻原则:1 热平衡温度必须在危险温度以下。 2 缩短开始冷冻到热平衡时间。 冷冻精液从理论上讲有无限期保存的可能，但保存时间过长，精子难免老化，受精能力下降。通常冷冻精液的保存期限为 1 ~2 年。 3 解冻方法 缓慢解冻—— 室温或0~5?下解冻 快速解冻—— 38 ~ 40?下解冻 II 胚胎冷冻保存技术 思考题: 1、胚胎移植的目的是什么, 2、请说明哺乳动物正常排卵过程中激素的调节作用。 3、说明超数排卵的设计思路。 4、影响超数排卵的因素有哪些, 5、为什么在胚胎移植前要对胚胎进行必要的检查。 6、试管动物技术包括哪些主要环节, 7、发育阻滞的原因及克服阻滞现象的方法, 第四章 动物细胞培养及细胞融合技术 4.1 动物细胞培养技术简介 一、 培养动物细胞的特点 细胞培养是指离体细胞在无菌条件下分裂、生长 ，在整个培养过程中不出现分化，不再形成组织。 组织培养的突出优点:便于应用各种物理、化学和生物等外界因素探索和揭示细胞生命活动的规律;便于应用各种不同的技术方法研究和观察细胞结构和功能的变化;可长期研究和观察细胞遗传行为的改变;可同时提供大量生物形状相同的细胞作为研究对象。 组织培养的局限性:组织和细胞离体以后，独立生存在培养环境中，其细胞生物学性质必然会发生某些改变。因此在利用培养细胞做研究对象时，应力戒与体内细胞等同起来，或作出轻率的判断。 1 动物细胞培养特点 动物细胞生长缓慢，对环境条件要求严格。不仅需要严格的防污染措施，同时还要用空气、氧、二氧化碳和氮的混合气体进行供氧和调节pH。原代细胞培养50代即开始退化。 2 生长特性 绝大部分哺乳类细胞尤其正常细胞均具贴壁依赖性生长的特征。但也有一些细胞，如淋巴细胞，能够在悬浮状态生长，细胞悬浮培养具有多方面的优越性，易于大规模生产，便于过程的控制 3 体外培养特点 对营养的要求较高，往往需要多种氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌呤、嘧啶、激素和生长因子等，其中很多成分系用血清、胚胎浸出液等提供，在很多情况下还需加入10,的胎牛或新生牛血清。 二、动物细胞培养的设备和装置 (一) 实验室 满足离体细胞生存所必须的条件和不受外界微生物污染的环境。通常包括准备室、无菌室、研究室三个主要部分。 无菌操作室在设计时应注意: 1 防止室内温度过高 2 天花板高度不要超过2米 3 室内要防止空气流动 4 内墙壁要光滑无死角 5 空气恒温恒湿调节器 (二) 常备装置 无菌条件:净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素 细胞生长条件:纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清 细胞检测条件:倒置显微镜，酶标仪 ，微孔板震荡器，高速离心机，移液器 细胞保存条件:液氮罐 , CO2培养箱:CO2培养箱设定的条件为37 ?，100%湿度，5,CO2 。使用CO2 培养箱培养细胞时应注意的问题: ? 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 ? 保持培养箱内空气干净。定期消毒(90 ?，14 h)。 ? 箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。 三 细胞生存条件和代谢 1 生存条件 , 细胞的营养需要 , 细胞的生存环境:渗透压;温度: 37?，O2;CO2: 5%，CO2 +H2O ??H2CO3 ??H+ + HCO3-;pH: 7.2,7.4 , 无污染 , 无毒 稳定住细胞生存环境中的CO2含量，即可维持培养基的氢离子浓度。用密闭瓶口的培养方法，培养基的pH值随CO2的增加会不断降低。自动控制的CO2恒温箱向箱内稳定地供5%的CO2 ，细胞可培养在开放的瓶皿中，培养环境能保持恒定的氢离子浓度，有利于细胞的生长。 初代培养的新鲜组织或经过消化分散状态的细胞，对环境的适应力差，细胞密度小时比细胞密度大时对pH变动的耐力差。这两种情况下应严格控制培养基的pH值，否则细胞难以生长。 培养的细胞需要以下12种基本氨基酸:精氨酸、组氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。 另外，还需要谷氨酰氨，它能促进各种氨基酸进入细胞膜，其所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源。 2 细胞代谢 糖代谢、类脂代谢、核酸代谢。 4.2 动物细胞培养的条件 一、细胞培养用液的配制 水:新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液(balanced salt solution，BSS)又称生理盐水或盐溶液，是细胞培养中常用的基本液体。它主要由无机盐和葡萄糖配制而成，起着维持渗透压、缓冲和调节酸碱度等重要作用。 配液时注意: (1)用水;配制先后顺序;称量，要看清药品的规格、纯度、结晶水的数量等。 (2)物质的纯度，常用的纯度有优级纯(特级纯)，分析纯(AR)和化学纯(CD)三种。 (3)物质的可溶性，避免沉淀析出。 (4)物质的稳定性，如葡萄糖只能在10磅下维持15,20分钟。 (5)贮存液 通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前临时混合和稀释，过滤除菌备用。 常用的缓冲液:生理盐水、PB、PBS(注意有无钙镁离子)，Hanks液(含有钙镁离子、葡萄糖、酚红)。 pH调节液 (1)碳酸氢钠液 可根据需要与使用方便配制10%以下的各种浓度。先用双蒸水溶解后，需经过滤除菌，分装小瓶中。亦可使用高压蒸气灭菌，密封，4?冰箱保存。市售有5%,10%浓度的安瓿封装品，使用也很方便。在调节pH过程中或超过要求值时，可用高压灭菌的10%醋酸溶液调节之。 (2)Hepes缓冲液 是一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂。通常使用浓度为10,15mmol/L。配制时，称取所需的Hepes量，用培养液溶解，用 ?冰箱保存。 1mmol/LNaOH调节pH至7.0，过滤除菌分装小瓶中，4 消化液 (1) 胰蛋白酶溶液: 一种黄白色粉末，易受潮，应密封放置阴暗干燥处。它的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来。常用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。 (2) EDTA(乙烯二胺与乙酸或)溶液: EDTA是一种化学螯合剂，毒性小，对贴壁细胞有离散作用。一般使用浓度为0.02%。15磅30分钟高压灭菌，4?或室温保存。 (3) 胰蛋白酶,EDTA的配制 0.5%胰蛋白酶液96mL，1%EDTA液4ml，无钙镁离子缓冲液100ml。 抗生素溶液 为防止细胞培养过程中发生污染，一般在培养液中加入青霉素钠盐和硫酸链霉素，其浓度分别为每毫升含100U和100μg 。配制时取青霉素1×106和链霉素1×106μg,溶于100ml Hanks或PBS中，使其含量为青霉素1×104U/ml，链霉素1×104μg/ml，使用时每100ml培养液中加入0.5-1ml。 二、培养基 培养基(培养液)是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基: , 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液(如鸡胚和牛胚浸液)。 , 优点:营养成分丰富，培养效果好。 , 缺点:来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支 原体污染。 合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。 , 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 , 优点:化生产，组分和含量相对固定。成本低 。 , 缺点:缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 血清的使用 , 血清质量好坏是实验成败的关键。 , 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质 量最好。 , 优质血清的标准:透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 , 血清的灭活(消除补体活性):56? ，30 分钟。 , 血清的消毒:过滤除菌。 抗菌素的使用 , 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 , 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100 单位。 , 庆大霉素:每毫升100单位---方便、广谱、稳定。 完全培养基的组成 , 基础培养基:80,一95, , 血清:5,一20, , 碳酸氢钠:2.0 g/L , 青、链霉素:各100单位,毫升 4.3 细胞和组织培养技术方法 体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。 一、细胞和组织培养的准备及操作方法 (一)培养前准备 【火焰消毒】:在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。 培养瓶;滴管、试管、吸管;接种环、接种针 【培养操作时注意】:进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。 不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。 (二)取材 (三)组织分离 (四)计数分装 1 细胞悬液 2 活体染色(台酚蓝) 3 细胞计数 4大格中细胞总数 各种组织要求不同，一般原代培养的细胞浓度在 1~10 ×105个/ml 分装到培养瓶中，放入二氧化碳培养箱开口培养或在普通恒温箱中37?闭口培养。 二、原代培养和传代培养培养原代方法 1、 单层细胞培养法 2 组织块培养法 传代培养(继代培养)方法 组织培养细胞一代生存期 组织培养细胞一代生存期 所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离再培养时 的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。 如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代(Generation)或倍增( Doubling)不同;在细胞一代中，细胞能倍增3,6次。 细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段: 潜伏期(Latent Phase); 指数增生期(Logarithmic growth Phase); 停滞期(Stagnate Phase). 三、培养细胞的观察和检测 细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌和病毒。无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等是主要的污染源。 严格的无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。 四、培养细胞的生物学特征 (一)体外培养细胞的分型 1. 贴附型:大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型: , 成纤维细胞 , 上皮型细胞 , 游走细胞型 , 多型细胞型 2. 悬浮型:见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。 , 概念:培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长 , 来源:自血，脾或骨髓 , 特点:在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 , 优点:生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态 , 缺点:观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞) 细胞形态变化:培养细胞结构与体内细胞相似，但在形态上与体内细胞有显著差别。 悬浮型细胞——不论原来属哪种类型的细胞，由于生存于液体环境中，泡体回缩，基本呈圆形。 贴附型细胞——细胞膜表面常附有由细胞分泌物形成的粘蛋白质膜(细胞外衣)，它对细胞运动，尤其对细胞贴附于支持物上有很大的作用。用胰蛋白酶消化能改变细胞外衣性质，使细胞易从支持物上脱离下来。 五、培养的细胞死亡 细胞死亡原因: 过程: 六、培养 细胞冷冻保存及应用 对具有一定特性的稳定的细胞系和细胞株的长期保存，一方面可以做细胞研究工作的实验材料，另一方面可以做细胞制品的生产材料，还可以做细胞工程的工具材料。 低温冷冻保存法 病因及药理的实验 原代培养细胞最接近体内细胞生长情况，因而适合作药物、病理和细胞分化实验。 , 在培养细胞中加入诱导因素，研究病因。 , 在培养细胞中加入药物，证明药物的药理作用。 , 遗传病的产前诊断 4.4 细胞融合技术 一、细胞融合技术发展简史 目前，细胞融合方法已向多样化和化学化方向发展。技术上已经能够在种内，种间的细胞进行杂交，甚至能够在动物界和植物界细胞之间进行杂交。 定义:细胞融合 (Cell fusion) 又称为细胞杂交(Cell hybridization)，指真核生物体细胞在体外培养条件下，用人工的方法，使两个或两个以上的细胞融合成一个双核或多核细胞的过程。 同核融合细胞—相同细胞形成的融合细胞 异核融合细胞—不同细胞形成的融合细胞 二、细胞融合技术的原理 (1)制备具有遗传标记的细胞; (2)用促融合剂或电场诱导细胞融合 (3)杂种细胞的选择性培养; (4)杂种细胞的鉴定。 在诱导物质的作用下，两个相互接触的体外培养细胞在细胞膜上发生一系列变化，首先使两个细胞的细胞质发生融合，经过有丝分裂过程两个细胞核合二为一。 4.5 细胞融合技术的方法 目前常用的细胞融合方法有: 1 病毒诱导细胞融合 2 化学诱导细胞融合 3 电场诱导细胞融合 一、病毒诱导细胞融合 可用于诱导融合的病毒有:仙台病毒、疱疹、麻疹、流感等十余种病毒。 仙台病毒:仙台病毒是一种RNA病毒，直径50一60mµm,其质膜表面具有两种糖蛋白，HANA蛋白和F蛋白。 HANA蛋白:能使病毒吸附在细胞膜表面，具有凝集素的作用。 F蛋白:具有质膜融合能力、细胞融合能力和溶血能力。 方法: 优点:1 对人和细胞毒性小。 2 容易灭活。 3 融合效率比较高。 4 许多培养细胞对其敏感。 , 缺点: 1 需经过病毒培养制备的繁琐过程。 2 批间差异大，重复性差。 3 难以标准化和大规模使用。 二、化学诱导细胞融合 可用于细胞融合的化学融合剂主要有: 1 高级脂肪酸衍生物。 2 磷脂集合体。 3 Ga离子络合物 4 特殊结构的水溶性高分子化合物 聚乙二醇(polyethylene glycol PEG)是乙二醇的多聚化合物，有一系列不同分子量的多聚体，通常选用1000―6000的PEG作为细胞融合的诱导物质。 1 PEG 可与细胞膜糖蛋白羟基之间构成氢键和疏水性作用力，以引起膜蛋白质凝集和膜脂质流动性改变。 2 PEG具有高度亲水性，可与水分子之间形成氢键，溶液中自由水消失，导致细胞脱水而发生膜结构的变化以促进膜融合。 方法: , 优点:1 操作简便 2 条件容易控制 3 易于推广 , 缺点:1 对细胞毒性较大 2 融合效率低 三、电场诱导细胞融合 该技术是80年代后建立的细胞融合技术，主要有两部分组成: 1 利用低强度非均匀交流电场，使两个或两个以上的细胞紧密排列，形成稳定的膜连续。 根据细胞大小，电场强度一般设定在10―100v/cm 2 瞬时施加高强度电脉冲，引起接触区域膜结构可逆性电击穿，随之发生接触膜的互融。膜可逆性电击穿所需电场强度高达0.5―10kv/cm，脉冲时间根据细胞种类不同在3―50s. * 膜可逆性电击穿不同于膜的力学破裂，其效果是可逆的。当撤去电场后，膜迅速恢复到原来的高电阻率和低渗透性状态。 优点: 1 空间定向，时间同步。 2 融合效率高，操作简便迅速。 3 对细胞无毒性。 缺点: 1 击穿电压、时间因细胞大小、种类而异。 2 脉冲缓冲液和恢复条件难于掌握。 3 融合后，细胞存活率低。 4.6 杂种细胞的筛选 杂种细胞的选择就是将真正发生异核融合的细胞筛选出来的过程 常用的选择方法有: 1 HAT(次黄嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶核苷)系统 2 AA(亚硝基羟基丙氨酸―腺嘌呤)系统 3 细胞行为特征的选择 HAT系统:根据核酸代谢过程中嘌呤和嘧啶的生物合成途径，设计的选择杂种细胞的培养液系统。 , H— 次黄嘌呤(Hypoxanthins) , A—氨基蝶呤(Aminopterin) , T—胸腺嘧啶(Thymidine) 正常核酸合成途径: 核酸合成的补救途径:次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT):具有将次黄嘌呤转化为嘌呤核苷酸的功能。胸腺嘧啶核苷酸激酶(TK):具有将胸腺嘧啶核苷转化为嘧啶核苷酸的功能。 原理:在核酸代谢过程中，氨基蝶呤(A)会阻断嘌呤和嘧啶的主要生物合成途径。但当存在HGPRT时，细胞可以利用外源的次黄嘌呤(H)合成嘌呤核苷酸。当存在TK时，可以利用外源的胸腺嘧啶(T)合成嘧啶核苷酸，这条“补救途径”能够保证具有HGPRT 和TK酶的细胞在培养基中同时存在A、H和T时的细胞生长。 细胞融合的应用 细胞融合方法法是遗传工程和细胞工程中的重要方法之一，通过它可以人为地改变细胞 的遗传性状，从而提高生物生产有用物质的能力或赋予生产新物质的能力等。当前，已在医 药、育种和开发能源等方面进行了尝试，并取得了可喜的成果。 1 用细胞融合方法生产单克隆抗体 2 用细胞融合方法实现远源物种之间的基因转移 3 用细胞融合方法培育新品种 4 用细胞融合方法进行基因定位 思考题: 1、什么是组织培养，它有哪些突出的优点和局限, 2、无菌操作室的设计原则有哪些, 3、绘出细胞培养室设计图并标注名称 4、细胞培养室有哪些常用的仪器设备, 5、动物细胞培养时为何要通入5%二氧化碳? 6、细胞融合的概念 7、细胞融合的方法有哪些,说出每种方法的优缺点。 8、杂种细胞筛选的原理及筛选过程。 第五章 单克隆抗体技术 哺乳动物具有一套完整的免疫系统用以保护自身的健康。机体对自己或异己的物质的识别及一系列反应称之为免疫反应(immune reaction)，体内的免疫系统包括体液免疫和细胞免疫两种。 能引起机体发生免疫反应使之产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内或体外与反应物发生特异结合的各类物质统称为抗原(antigens)。 抗体是一种免疫球蛋白(immunoglobulin Ig)，当机体受到细菌、病毒或其它抗原攻击时，由B淋巴细胞发育的浆细胞就增殖、产生对这些抗原相应的抗体。 一 单克隆抗体的基本原理 单克隆抗体技术(monoclonal antibody technology)通常又称为杂交瘤技术(Hybridoma technology)。 克隆:由一个细胞繁殖而形成的具有相同遗传特征的细胞 单克隆抗体:由一个抗体形成细胞大量增殖形成的克隆所产生的抗体 B淋巴细胞能产生特异性抗体，在体外培养条件下只能存活10-20天。 骨髓瘤细胞在体外培养条件下可以大量繁殖和长期存活，但其分泌的骨髓蛋白却没有免疫性。 二 杂交瘤技术的基本条件 杂交瘤技术大体涉及到供给融合的骨髓瘤细胞，免疫动物的选择，免疫方法，培养条件与融合剂的使用等几个问题。 三 杂交瘤技术的过程 1 免疫动物脾细胞的制备 2 饲养细胞:胸腺细胞 脾细胞 腹腔巨噬细胞 3 细胞融合的步骤与方法 方法 1 中国医学科学院基础医学研究所 方法 2 巴黎血液中心杂交瘤实验室 方法 3 北京医学院微生物教研室 方法4 中国科学院上海细胞生物研究所 四 抗体的筛选 1 固相放射免疫结合测定法 2 固相酶标免疫测定法 五 杂交瘤细胞的克隆化 克隆化培养的方法，按照分离单克隆细胞的不同手段，大体上可分为:有限稀释法，软 琼脂平板法，显微操作法及荧光激活法。 有限稀释法 六 单克隆抗体的大量制备 1 体外培养法 2 动物体内培养法 七 单克隆抗体的分离、纯化与保存 1 盐析法纯化单克隆抗体 通常硫酸铵浓度不同，析出的蛋白不同。 2 亲和层析法纯化单克隆抗体 亲和层析的原理是利用蛋白质、核酸及其它生物成分，通过共价键联结到活化的固相载体上。再经过免疫吸附或解吸附以洗脱纯化抗体。 固相载体应具备以下条件:不溶于水;具有巨大的表面积和能与配体结合的丰富化学集团;机械性能与化学性能稳定;液体通流性良好 3 DEAE离子交换层析法 4 蛋白质A-琼脂糖珠亲和层析法 5 单克隆抗体的保存 , 培养液内的单克隆抗体的保存:上清 + 0.1%叠氮钠 4?以下保存 , 血清和腹水内单克隆抗体的保存: -70 ?或-20 ?短期保存 , 纯化的单克隆抗体保存: 抗体溶于PBS中+ 0.1%的叠氮钠 4 ?以下保存 杂交瘤技术流程概要 单克隆抗体的应用 1 用于医学诊断 2 用于治疗疾病 3 制备各种生物活性物质 4 是重要的基础研究工具 思考题: 1、归纳总结单克隆抗体的原理 2、杂交瘤技术流程说明 第六章 染色体工程 染色体工程(chromosome engineering):是人们按照 一定的设计， 有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体的技术。广义上讲，它还包括染色体内部的部分遗传操作。 6.1 多倍体技术 一 人工诱导多倍体 某些多倍体动物具有生长速度快，成活率高及抗病能力强等特点，被广泛应用于改善低等动物(鱼、两栖类)经济性状的育种中。 (一) 人工诱导多倍体的方法 多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，既通过抑制受精卵第二极体的排出产生三倍体或抑制第一卵裂产生四倍体。 目前广泛应用的诱导方法有:生物学、物理学和化学方法 1 生物学方法 生物学方法主要是通过杂交尤其是通过种间杂交的方法获得 种间杂交导致受精卵发育过程中第二极体不排出，产生多倍体。 2 物理学方法 物理学方法 用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体或四倍体的方法，其特点是廉价、易操作，有利于养殖场大规模生产使用。 技术关键:阻止第一次受精卵分裂或第二极体的排出。 1温度处理开始时间 2温度处理持续时间 3处理温度 B 水静压法:利用较高的静水压力(600kg/cm2)来阻止第二极体的排出或第一次卵裂产生多倍体的方法。 技术条件:需要专门的设备——水压机 技术关键:1 掌握时机:第二极体排出前(三倍体)，第一次卵裂前(四倍体)。 2 处理时间、水压强度。 特点:1 诱导率高(90%~100%) 2 处理时间短(3~5分钟) 3 受精卵损伤小、成活率高 4 处理卵的数量有限 3 化学方法 利用化学物质来阻止第二极体的排出或第一次卵裂产生多倍体的方法。 一些麻醉剂也可用于诱导多倍体的形成 化学药品一般都具有毒性，影响处理后的胚胎发育，且很容易形成镶嵌体。 二、多倍体倍性的鉴别方法 1 核体积测量 组成多倍体有机体的细胞及细胞核通常要比二倍体大一些。但多倍体的器官或身体并不一定都比二倍体大。 在鱼类，通常用测量红血球的方法来鉴定多倍体的倍性，其中核体积之比最为常用。 除红血球外，脑细胞、上皮细胞、肝细胞、及肾细胞的核体积之比都可用于鉴定染色体的倍性。 2 生化分析 丙酮酸激酶活性:2n:3n = 1:1.68 磷酸果糖激酶:2n:3n=1:1.35 己糖激酶:2n:3n=1:1.26 3 染色体计数 利用胚胎或淋巴细胞制备的染色体标本，直接计数染色体数目。 4 DNA含量测定 流式细胞仪准确测定细胞核DNA含量。 三、多倍体的应用及发展趋势 动物多倍体研究的早期阶段主要侧重于三倍体诱导方法、最佳诱导条件的研究，即如何获得大量的三倍体。80年代以后则转向三倍体倍性效应的研究和四倍体诱导的研究。 1 多倍体动物生活力和生长能力 诱导三倍体可以增加种间杂种的成活率 2 多倍体动物的性腺发育及应用 三倍体预期是不育的，因为奇数染色体组将导致减数分裂的瓦解以及性腺发育的衰退或非整倍体配子的产生。实验证明三倍体确实是不育的，但副性征并不受影响。 动物性腺发育及伴随性成熟会出现肉质变差，生长速度变慢及较高的死亡率。 一般三倍体雄鱼的性腺比雌鱼的性腺发育好一些，但无产生正常精子的能力。 四倍体是可育的，但减数分裂时多价染色体配对会导致非整倍体配子的产生，所形成的配子并不是全都可育的。 目前对四倍体的研究主要是应用其与二倍体杂交产生不育的三倍体。 3多倍体的意义 1 控制过度繁殖，增加生长速度以及延长寿命。 2 部分多倍体在肉质及抗性方面优于二倍体。 3 部分多倍体的耐受性超过二倍体。 6.2 雌、雄核发育技术 用人工的方法使卵或精子的染色体失活，再使受精卵的染色体组加倍。 一、人工诱导 雌核发育(gynogenesis)技术 精子虽然正常的进入和激活卵子，但其遗传物质并未参与卵子的发育，精子的染色体很快消失，胚胎发育仅在母体的遗传物质控制下完成。 (一)定义: 人工诱导雌核发育是指用经过紫外线、X或γ射线等处理后的失活精子来“受精”，再在适当时间施以冷、热、高压等物理处理，以抑制第二极体的排出，使受精卵发育成为正常的二倍体动物。 技术关键:只有在适当的辐射剂量下，才能导致精子染色体完全失活，届时精子具有进入卵子的能力，却只能起到激活卵球启动发育的作用。 (二) 方法 1 精子遗传物质灭活 物理方法:γ射线、X射线、紫外线。 化学方法:甲苯胺兰、乙烯脲、二甲基硫酸盐。 此外，采用显微手术直接除去受精卵中雄原核的方法，最近也已在小鼠上成功地得到了雌核发育的二倍体。 2 染色体组加倍 通过阻止第二极体排出，形成雌核发育二倍体。这种雌核发育称为极体雌核发育 通过阻止受精卵第一次有丝分裂，诱导雌核发育成二倍体。这种雌核发育称为有丝分裂雌核发育(Mitotic gynogenesis)。 3 雌核发育的鉴别:形态学鉴别 细胞学鉴别 遗传标记鉴别 4 雌核发育的意义 , 雌核发育具有产生单性种群的能力 , 雌核发育能迅速地产生同源型二倍体克隆，为育种和基础生物学研究提供了途径。 二、人工诱导雄核发育技术 雄核发育是指卵子经过射线处理，使其遗传物质失活，与正常精子受精，再施以温度或高压处理，抑制第一次卵裂，使精子的染色体加倍为二倍体而发育成完全表现父本遗传性状的纯合个体。 1 卵细胞染色体遗传失活 A 辐射——辐射具有较好的穿透力，主要能诱发染色体的断裂。 问题:可能使线粒体DNA、信使RNA及其它结构随染色体DNA一同被破坏。 B 紫外线——DNA经紫外线照射后氢键断裂，使DNA结构局部变形，影响DNA正常的转录和复制。 问题:由于穿透力的限制，卵子的种类、大小、形态和透明度都会对其产生影响。 C 卵子的过熟或老化 2 雄核发育二倍体诱导技术 雄核发育的单倍体能较好的通过胚胎发育，但在孵化期大量死亡。雄核发育二倍体的诱导只能通过阻止受精卵第一次有丝分裂完成。 6.3 动物的性别控制技术 性别控制:指通过人为地干预或操作，使动物按人们的愿望繁殖出所需性别的后代的技术。 性别控制的意义:1 提高畜牧业的经济效益 2 防止性连锁疾病的发生 3 加快珍稀动物的繁殖、保种过程 4 提供遗传基础理论研究的途径 一、 性别决定与性染色体 不同生物性别决定的机制有所不同，大多数决定于性染色体的差异，少数取决于体细胞染色体的倍数性，极少数决定于个体发育所处的内外环境条件。 1. 雄性异配子型 — 雌性个体只产生一种染色体组成的配子，雄性个体产生两种不同类型的配子。 2. 雌性异配子型 — 雄性个体只产生一种染色体组成的配子，而雌性个体产生两种不同的配子。 3 雄性单倍性 — 没有单独的性染色体存在，其性别决定于卵细胞是否受精。 环境决定性别:某些两栖类、爬行类动的性别受其早期胚胎，发育环境温度变化的控制。 早期胚胎发育中的性腺是中性的，由皮质和髓质两部分组成 在个体发育中:皮质发育，髓质退化——发育为雌性 二、性别控制的方法 1 分离异性型精子 按照性染色体决定性别的理论，在XX-XY性别决定的动物中，雌雄性别取决于入卵时精子所带的性染色体是X染色体还是Y染色体。 A 电泳法 B 液柱分离法 C 免疫法 D 沉降法 2 分离异型卵子 在ZW-ZZ性别决定的动物中，雌雄性别取决于卵子所带的性染色体是Z染色体还是W染色体。 A 性别自动鉴别品系 B 伴性平衡致死系 C 体色限性遗传品系 3 性反转法 外源激素作用:激素处理的性反转鱼不能遗传，因此每代都要用激素处理。 4 雌核发育和性反转 5 早期胚胎性别鉴定 A 细胞遗传学分析方法:通过核型分析对胚胎进行性别鉴定。准确率高，费时，费力，对胚胎浪费大 B 生化分析法:通过测定与X染色体相关联的酶的活性来鉴定雌性胚胎的方法。准确率高， 时间难以掌握 C 免疫学方法:利用H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体检测胚胎上是否存在雄性特异性H-Y抗 原，进行胚胎性别鉴定的方法。 D DNA探针检测法:利用Y染色体上的特异探针，通过与胚胎细胞DNA的杂交，检 测雄性胚胎的方法。 6 控制早期胚胎发育的条件 部分鱼类、两栖类、爬行类动物的性别受其胚胎早期发育条件的影响较大，可通过控制 发育条件来实现性别控制。 7 控制受精条件 pH升高Y型精子快，X型精子慢——雄性 8 种间杂交法 尼罗罗非鱼性别决定为XY型——?(XX)， ? (XY) 奥利亚罗非鱼性别决定为ZW型——?(ZW)， ? (ZZ) 染色体工程的应用意义 , 建立近交系 , 性别控制，繁育单性种群 , 提高生长率和出肉率 , 提高成活率和抗逆性 思考题: 1 染色体工程 2 人工诱导多倍体有哪些方法, 3 通过哪些方法可以鉴别一个生物个体的倍性, 4 雌核发育 5 雄核发育 6 人工诱导雌核发育要解决哪些关键问题, 7 通过哪些方法可以实现人类对动物性别的控制, 第七章 细胞拆合与重组(细胞质工程) 用人工的方法，将完整的细胞核和细胞质分离或杀死细胞核，再把不同来源的细胞核与细胞质重新组合形成核质杂交细胞——细胞质工程(细胞核移植技术) 7.1 细胞核移植的技术方法 细胞核移植最早是用来研究核质关系和核的全能性的 自从DNA双螺旋结构学说问世以来，解决了不少的遗传方面的问题，而发育过程中分化问题就突出了。细胞质和细胞核之间的相互关系是分化过程中的重要问题，细胞核的移植是研究这个问题的和好方法。 一、方法 供体——提供细胞核的细胞 受体——接受细胞核的细胞(目前为动物的卵子) 一般原则: 1 卵子在接受外来核之前必须被激活以获得发育能力 2 微吸管的直径要稍大于核直径，小于细胞直径。 3 核移植过程中要避免核与外界接触 4 核连同它外面裹的一薄层细胞质一同注入受体 1 两栖类 2 鱼类 鱼类、两栖类的细胞核移植技术的建立，为哺乳类体细胞克隆技术打下了实验基础。但在相当长的一段时期内，许多科学家将这个成功归因于这些细胞自身的特点，认为在哺乳类中无法进行该实验。 3 哺乳类的细胞核移植 相对于鱼类、两栖类，哺乳动物的卵细胞体积小。 鼠 80微米 兔 125微米 牛 140微米 人 100微米 1981年1月 首次报道小鼠核移植成功 二 核移植应用前景 1 细胞核的分化问题 细胞分化以后，究竟核起不起变化, 如果有变化，是什么时候开始的, 观点1 细胞核促进分裂活动的能力和促使正常发育的能力有显著的降低，这种降低从原肠期开始。细胞核的发育能力由全能逐渐特化。 结论:分化了的细胞的核是存在改变的。 观点 2 在已经分化的细胞中，细胞核仍然保留着促进分裂活动和促使正常发育的全部潜能，不存在核内不可逆的失活或永久性的变化。 结论:分化了的细胞的核并没有特化 阻止成体细胞的核移植成功的原因: A 成体细胞较小，核移植时容易受伤。 B 分化的细胞，大多分裂较慢或不分裂。它的核移到卵子中后，很难与受体细胞的分裂周期同步。 2 细胞质对核的影响 A DNA的合成受细胞质影响很大 B 在个体发育过程中部分性状受细胞质影响 3 用核移植技术生产克隆动物 4 扩繁转基因动物后代 5 通过异种克隆保存珍稀动物 7.2 克隆(clone)动物 分子克隆——指人工扩增生物大分子(如DNA克隆) 细胞克隆——指人工复制细胞，即通过单细胞培养获得遗传性状完全一致的细胞。 生物体克隆——指用无性繁殖的方法，从体细胞得到遗传上与原来生物体完全相同的生物 体，既人工复制生物体。 胚胎分割法 将发育早期胚胎经显微手术后，分割为多等份的细胞，通过植入受体而产生的多个遗传性完全一致的后代。 二等份胚胎分割法成功的动物:小鼠、兔、山羊、绵羊、 猪、马、牛。 四等份胚胎分割法成功的动物:小鼠、绵羊、牛。 从严格意义上讲，胚胎分割法克隆算不上真正的克隆，这种胚胎克隆只能算“多胞胎复制”。 294 一、动物克隆的类型 1 胚胎细胞的克隆 1980年，Willadsen 将从绵羊八细胞胚胎中分离的胚胎细胞，移入已去核的同种绵羊的 卵细胞中，经培养获得胚胎，再将胚胎植入代理母羊体内，首次获得了胚胎细胞克隆羊。 2 已分化的体细胞克隆 1997年 Wilmut等用高度分化的乳腺上皮细胞克隆出“多利”绵羊 克隆羊产生的过程, 克隆羊解决了供体细胞与受体细胞同步化问题。克隆动物经历了同种胚胎细胞克隆、同种体细胞克隆的历史阶段、正向异种动物体细胞克隆的方向发展。 异种克隆大熊猫 异种克隆大熊猫涉及两大问题: 1 虽然体细胞核在同种的卵胞质中能分化发育，那么大熊猫体细胞核能否在异种动物的细胞质中去分化并支持早期胚胎发育, 2 发育早期的重构胚能否在母体内着床并进行全程发育, 二、克隆动物成功的意义: 生物学意义: 1 它证明一个完全分化了的动物体细胞仍然保持着全部的遗传信息和形成完整个体的能力。 2 为生产基因克隆体提供了可能 3 为研究对基因进行有规律的调控奠定了基础 经济意义: 人类能利用这种技术快速、大量繁殖优良品种的动物和珍稀动物，还能将各种具有重要经济性状的基因转入供体细胞，然后克隆出具有新性状的经济动物。 思考题: 1 目前对哺乳动物的克隆方法可分为几种方法, 2 克隆羊成功的根本原因，在于他们解决了哪些重大的技术问题, 3 克隆羊成功的生物学意义 第八章 转基因动物 8.1 转基因动物的原理和方法 1982年，英国的《自然》杂志发表了一篇文章:有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中，培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快2,3倍，体积大一倍。 一、转基因动物的概念 借助分子生物学实验手段，将特定的目的基因从某一生物体分离出来，进行扩增和加工，再导入动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳定地整合有人工导入的外源基因的动物称转基因动物(Transgenetic Animals)。 转基因动物是基因工程与细胞工程技术结合的产物。 二、转基因动物的技术程序 1 目的基因的提取、构建和克隆 2 外源目的基因向生殖细胞或胚胎干细胞导入 3 受精卵或胚胎组织培养和胚胎移植 4 筛选及鉴定出稳定的转基因动物品系 (一)目的基因的制备 1 利用限制性内切酶，从基因组中获取目的基因，所获基因片段的大小与限制性内切酶的识别位点碱基数目有关。 2 通过mRNA合成cDNA 3 人工体外合成DNA片段 利用DNA合成仪，体外合成一段DNA的编码序列。对分子量较大的基因，可以通过分段合成，再组装连接。 4 PCR扩增特定基因片段 利用聚合酶链式反应，在已知基因两端序列的情况下，可以通过PCR反应将基因直接调出。 现代转基因技术中的“基因”不是仅仅是目的蛋白编码序列(coding sequence)的DNA片断，而是包括基因表达的一整套顺式作用元件(cis-acting elements)。 (二)目的基因的克隆 1 通过载体在适当的宿主中克隆 载体—— 基因工程中外源DNA片段的运载工具，是通过对天然质粒、噬菌体和病毒的人 工改造构建成的。 2 通过PCR反应克隆目的基因 (三) 目的基因的导入 1 显微注射法 显微注射法是在显微注射仪上，一侧用吸管固定受精卵，另一侧将注射针插入受精卵原 核(一般是雄原核)。拔出显微注射针解除固定管的负压，操作完成。 显微注射法是最早使用、至今仍在使用的较成熟的基因导入方法。 操作要求: 注射量1~2nl 浓度1~3ug/ml 高纯度DNA 操作过程: 制备持卵管与注射针 显微操作仪上进行显微注射 显微注射的优点: 1 对导入的基因大小要求不严(可高达50kb) 2 导入效率高，常能获得良好的表达 3 可直接转移不含载体片段的DNA 显微注射的缺点: 1 外源基因是数目不等串珠状随机整合的受体染色体上，其表达水平在转基因个体内不稳 定。 2 插入的位点不能控制。 3 不能对发育较晚的胚胎进行操作。 2 病毒载体法 细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中扩增和表达。动物病毒载体是较理 想的真核基因工程载体。 病毒DNA序列中有很强的启动子，可使其后方的外源基因高产量和高频率地表达。常 用的有杆状病毒载体、SV40载体、痘苗病毒载体、逆转录病毒载体等。 优点:基因转移效率、感染率、整合率高。 对多细胞发育阶段的胚胎十分有效。 缺点:外源基因转入，但常会发生不表达——病毒载体末端 序列易甲基化而失活。 载体容量有限，只能转移小片段DNA。 有可能产生病毒污染。 3 精子载体法 优点:符合正常生理过程，可避免原核的损伤。 缺点:重复性差。 电脉冲法:将受精卵与外源DNA按一定的比例混合，放入电脉冲杯中，在一定强度的脉冲电压下，外源DNA进入受精卵。 基因枪法:将外源DNA包裹在钨粒表面，经高速发射后进入靶细胞从而实现基因转移。 三、 转基因动物中外源基因的表达 外源基因进入细胞后的命运 1 整合到染色体内 随机整合 定点整合 2 游离在细胞浆内暂态表达 3 在核酸酶的作用下降解 随机整合(Random insertion) 外源基因随机插入到染色体的任意部位。 插入到致死基因序列内:胚胎死亡 插入到功能基因序列内:基因失活 插入到某调控区作用范围:外源基因表达增强/减弱 8.2 转基因动物研究中存在的问题 1.制作转基因动物效率极低 这是目前几乎所有从事转基因动物研究的实验室都面临的问题，也是制约这项技术广泛应用的关键。 2. 难以控制转基因在宿主基因组中的行为 转基因在宿主基因组中的插入是随机的，这种行为可能导致内源基因的破坏或失活，也可能激活正常情况下处于关闭状态的基因。其结果便导致转基因阳性个体出现不育、胚胎死 亡、四肢畸形，足趾相连等异常现象。 3.大部分转基因表达水平极低，而极少部分转基因表达水平过高。 4.阳性转基因动物筛选不易 由于大动物的妊娠期较长，所育子代数目有限，所以给筛选带来很大的困难。现在，一般采用PCR法和Southern杂交法对含有外源DNA的受精卵进行整合率的检测。 5. 一些环境和社会安全问题 通过人工对生物甚至人的基因进行相互转移，转基因生物已经突破了传统的界、门的概念，具有普通物种不具备的优势特征，通过基因漂移，会破坏野生近缘种的遗传多样性。另外对人体健康也有威胁和影响，如转入的生长激素类基因就有可能对人体生长发育产生重大影响。为了预防和控制转基因生物可能产生的不利影响，联合国于2000年通过了《卡塔赫纳生物安全议定书》。 转基因动物的方法 思考题: 1、什么是转基因动物, 2、制作转基因动物的技术流程 3、目前转基因动物研究中存在的问题,