微波加热的时间对牛奶中细菌总数的影响[要诀]

微波加热的时间对牛奶中细菌总数的影响[要诀] 微波加热的时间对牛奶中细菌总数的影响 摘 要: 【 目的】牛奶是牛乳的俗称，各种牛乳中常含一定数量的微生物。牛奶中的微生物主要来自奶牛体内以及挤奶、贮存、运输等过程中从外面的污染。生牛奶中的微生物包括细菌、真菌和酵母菌，其中以细菌的数量最多。生牛奶中的细菌总数大都在几万到几百万之间，污染严重的可超过一千万。从奶牛乳房挤出的奶并非是无菌的，在健康奶牛的乳房内也总有一些细菌存在，但仅限于极少数几种细菌，如小球菌、链球菌等，细菌的数量不多，大约在每毫升几百个左右。如奶牛发生乳房炎，则在奶中会检出大量的金黄色葡萄球菌、链球菌和化脓杆菌等致病菌。所以在健康牛的奶中，大多数微生物来自于牛的体皮肤和外环境，以及奶离开奶牛后细菌的快速增殖。牛奶的细菌总数很大程度上决定于环境卫生、挤奶机、牛奶贮存和运输设备的清洁程度和牛奶的冷藏温度。能在越短的时间内把牛奶温度降至4?左右，牛奶中的微生物总数就越低。本实验应用平板菌落技术测定水中细菌总数，计算出来的细菌总数仅是近似值。目前一般采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在保证无菌的环境下，采取不同时间用微波加热牛奶的样品，利用培养基制作平板，对牛奶用平板菌落技术测定细菌总数。牛奶的微生物学检验，在保证牛奶安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价乳品状况的重要指标。 平板菌落计数技术 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 细菌关键字:自来水 0引言 牛奶，是最古老的天然饮料之一。其营养成份很高，牛奶中的矿物质种类也非常丰富，除了我们所熟知的钙以外，磷、铁、锌、铜、锰、钼的含量都很多。最难得的是，牛奶是人体钙的最佳来源，而且钙磷比例非常适当，利于钙的吸收。据美、英两国医学专家研究发现，牛奶中含有两种过去人们未知的催眠物质，其中一种是能够促进睡眠的以血清素合成的色氨酸，由于它的作用，往往只需要一杯牛奶就可以使人入睡;另外一种则是具有类似麻醉镇静作用的天然吗啡类的物质。所以，如果在早晨饮奶，就必然会使人的大脑皮层受到抑制，影响白天的工作和学习。近年来，随着人们生活水平的提高，和对健康认识的加深，在各种媒体的宣传作用下，人们已开始逐渐认识到牛奶的营养价值，越来越多的家庭开始有意识的把牛奶列入日常食谱中。所以牛奶质量的好坏对人们生活起着至关重要的作用，而判断牛奶品质的标准，微生物在鲜奶中的数量、种类是必不可少的。我国鲜牛乳的 显微卫生标准为原奶中细菌数最大值为200万个每毫升。长期以来，国内多采用 镜计数法、美蓝还原酶实验法、标准平板计数法进行测定, 确定不同来源的生牛乳的等级、巴氏消毒牛乳的卫生标准。微生物显微镜直接计数法随机性大,对菌体数量不能做出较为宏观,全面的反应.优点是计数快速; 美蓝还原酶实验法是用于测定牛乳质量的一种定性检测法, 操作简便, 不需特别设备.它不能做为定量检查; 平板菌落计数法速度慢,需要平板上长出菌落一段时后才能计数。由于平板菌落计数法通常间做梯度稀释,所以计数的线性范围大.由于是菌悬液涂布,所以比较均匀,能较好的反应菌落的疏密程度.重复性,平行性很好,是经典的计数方法。 1 材料与方法 1.1 试验时间于2011 年11月在食品学院微生物内完成 1.2 材料 1.2.1实验材料 生牛奶 1.2.2实验试剂 酵母浸膏 蛋白胨 葡萄糖 琼脂 1mol/LNaOH 1mol/LHCl 蒸馏水 1.2.3实验仪器 高压蒸气灭菌锅 灭菌培养皿 灭菌锥形瓶 天平 玻璃棒 微波炉 药匙 pH试纸(pH5.5-9.0) 温度计 灭菌移液管 灭 菌试管 恒温培养箱(36?1)? 菌落计数器 洗耳球 玻 璃珠 酒精灯 牛皮纸 棉线 1.3 实验方法 1.3.1 制备平板计数琼脂培养基 1.3.1.1 称量 按培养基配方依次准确的称取酵母浸膏2.5g,蛋白胨5.0g,葡萄 糖1.0g，琼脂15.0g，放入烧杯中。酵母浸膏常用玻璃棒挑取，放在称 量纸上，称量后直接放入水中，稍微加热，便会与酵母浸膏称量纸分离， 然后立即取出纸片。 1.3.1.2 溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，并放入两颗玻璃珠，用 玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，将称好的琼脂放入已溶 的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。 1.3.1.3 调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果 偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用 pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/L HCl进行调节。 1.3.1.4 分装 待其冷却至室温后，分装于灭菌锥形瓶中，并包扎妥当。 1.3.2 生理盐水的配制 1.3.2.1 称量 准确称取氯化钠8.5g放入烧杯中，用蒸馏水溶解 1.3.2.2 定容 把烧杯中的溶液转移至1000毫升的容量瓶中，并用蒸馏水反复 冲洗烧杯，冲洗烧杯的试液依旧倒入容量瓶中，至刻度线时用胶头滴管 地至刻度线处，盖上玻璃塞，上下摇匀。 1.3.2.3 取出灭菌试管，向每支试管中移取9ml的生理盐水，盖上试管塞，并包 扎妥当。 1.3.3 灭菌 1.3.3(1 首先将内锅层取出,再向外锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜。 1.3.3.2 放回内锅层,并加入用报纸包好的培养基、装有生理盐水的试管。 1.3.3.3 加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方 式同时旋紧相对的两个螺旋，使螺旋松紧一致，勿使漏气。 1.3.3.4 用电炉加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷气。待冷空 气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。 当锅内压力上升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实 验用0.1MPa,121?,20min灭菌。 1.3.3.5 灭菌时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力 降至“0”时打开排气阀，旋松螺旋，打开盖子，取出灭菌物品。 1.3.4 生牛乳样品的采取 倒取约250ml生牛乳样品于锥形瓶，以待分析。 1.3.5 细菌总数测定 1.3.5.1生牛乳中细菌总数的测定 1.3.5.1.1 在无菌条件下，灭菌移液管吸取1mL样品，沿试管壁缓缓注入含有 9ml灭菌生理盐水的试管中，震摇试管，混合均匀，做成1:10的样 品稀释液。另取一支含有9ml生理盐水的灭菌试管，移取1ml的1:10 试液于其灭菌试管中，做10倍递增样品稀释液。另外，用此法做出 1:1000的样品稀释液。 1.3.5.1.2 根据食品卫生标准要求或对检验污染情况的估计，选择2,3个适宜 样品稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该样品稀释 液的吸管移1ml样品稀释液于灭菌平皿内，每个样品稀释度做两个平 皿。 1.3.5.1.3取一空的灭菌培养皿，移取1ml灭菌生理盐水，倾注肉膏蛋白胨琼脂 培养基，培养基的量为培养基高度的1/3,作空白对照。 1.3.5.1.4用1ml灭菌移液管取1:10的样品试液于平皿，倾注溶化并冷却到45? 左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的1/3,并 立即在桌上作平面旋摇，使牛奶样液和培养基混匀。 另取1ml灭菌移液管取1:100的样品试液于平皿，倾注溶化并冷却到 45?左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的1/3, 并立即在桌上作平面旋摇，使牛奶样液和培养基混匀。 再取1ml灭菌移液管取1:1000的样品试液于平皿，倾注溶化并冷却 到45?左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的 1/3,并立即在桌上作平面旋摇，使牛奶样液和培养基混匀。 1.3.5.1.5 待培养基凝固后，倒置于37?温箱中，培养48h，进行菌落计数。。 1.3.5.2 取250ml生牛乳置于微波炉中，高火微波1分钟，测该牛乳中细菌的总数 1.3.5.2.1 在无菌条件下，灭菌移液管吸取1mL样品，沿试管壁缓缓注入含有 9ml灭菌生理盐水的试管中，震摇试管，混合均匀，做成1:10的样 品稀释液。另取一支含有9ml生理盐水的灭菌试管，移取1ml的1:10 试液于其灭菌试管中，做10倍递增样品稀释液。另外，用此法做出 1:1000的样品稀释液。 1.3.5.2.2 根据食品卫生标准要求或对检验污染情况的估计，选择2,3个适宜 样品稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该样品稀释 液的吸管移1ml样品稀释液于灭菌平皿内，每个样品稀释度做两个平 皿。 1.3.5.2.3取一空的灭菌培养皿，移取1ml灭菌生理盐水，倾注肉膏蛋白胨琼脂 培养基，培养基的量为培养基高度的1/3,作空白对照。 1.3.5.2.4用1ml灭菌移液管取1:10的样品试液于平皿，倾注溶化并冷却到45? 左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的1/3,并 立即在桌上作平面旋摇，使牛奶样液和培养基混匀。 另取1ml灭菌移液管取1:100的样品试液于平皿，倾注溶化并冷却到 45?左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的1/3, 并立即在桌上作平面旋摇，使牛奶样液和培养基混匀。 再取1ml灭菌移液管取1:1000的样品试液于平皿，倾注溶化并冷却 到45?左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的 1/3,并立即在桌上作平面旋摇，使牛奶样液和培养基混匀。 1.3.5.2.5 待培养基凝固后，倒置于37?温箱中，培养48h，进行菌落计数。 1.3.5.3 取250ml生牛乳置于微波炉中，中低火2分钟，测该牛乳中细菌的总数 1.3.5.3.1 在无菌条件下，灭菌移液管吸取1mL样品，沿试管壁缓缓注入含有 9ml灭菌生理盐水的试管中，震摇试管，混合均匀，做成1:10的样 品稀释液。另取一支含有9ml生理盐水的灭菌试管，移取1ml的1:10 试液于其灭菌试管中，做10倍递增样品稀释液。另外，用此法做出 1:1000的样品稀释液。 1.3.5.3.2 根据食品卫生标准要求或对检验污染情况的估计，选择2,3个适宜 样品稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该样品稀释 液的吸管移1ml样品稀释液于灭菌平皿内，每个样品稀释度做两个平 皿。 1.3.5.3.3取一空的灭菌培养皿，移取1ml灭菌生理盐水，倾注肉膏蛋白胨琼脂 培养基，培养基的量为培养基高度的1/3,作空白对照。 1.3.5.3.4用1ml灭菌移液管取1:10的样品试液于平皿，倾注溶化并冷却到45? 左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的1/3,并 立即在桌上作平面旋摇，使牛奶样液和培养基混匀。 另取1ml灭菌移液管取1:100的样品试液于平皿，倾注溶化并冷却到 45?左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的1/3, 并立即在桌上作平面旋摇，使牛奶样液和培养基混匀。 再取1ml灭菌移液管取1:1000的样品试液于平皿，倾注溶化并冷却 到45?左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的 1/3,并立即在桌上作平面旋摇，使牛奶样液和培养基混匀。 1.3.5.3.5 待培养基凝固后，倒置于37?温箱中，培养48h，进行菌落计数。 1.3.5.4 取250ml生牛乳置于微波炉中，中低火3分钟，测该牛乳中细菌的总数 1.3.5.4.1 在无菌条件下，灭菌移液管吸取1mL样品，沿试管壁缓缓注入含有 9ml灭菌生理盐水的试管中，震摇试管，混合均匀，做成1:10的样 品稀释液。另取一支含有9ml生理盐水的灭菌试管，移取1ml的1:10 试液于其灭菌试管中，做10倍递增样品稀释液。另外，用此法做出 1:1000的样品稀释液。 1.3.5.4.2 根据食品卫生标准要求或对检验污染情况的估计，选择2,3个适宜 样品稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该样品稀释 液的吸管移1ml样品稀释液于灭菌平皿内，每个样品稀释度做两个平 皿。 1.3.5.4.3取一空的灭菌培养皿，移取1ml灭菌生理盐水，倾注肉膏蛋白胨琼脂 培养基，培养基的量为培养基高度的1/3,作空白对照。 1.3.5.4.4用1ml灭菌移液管取1:10的样品试液于平皿，倾注溶化并冷却到45? 左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的1/3,并 立即在桌上作平面旋摇，使牛奶样液和培养基混匀。 另取1ml灭菌移液管取1:100的样品试液于平皿，倾注溶化并冷却到 45?左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的1/3, 并立即在桌上作平面旋摇，使牛奶样液和培养基混匀。 再取1ml灭菌移液管取1:1000的样品试液于平皿，倾注溶化并冷却 到45?左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的 1/3,并立即在桌上作平面旋摇，使牛奶样液和培养基混匀。 1.3.5.4.5 待培养基凝固后，倒置于37?温箱中，培养48h，进行菌落计数。 1.3.5.5 取250ml生牛乳置于微波炉中，中低火4分钟，测该牛乳中细菌的总数 1.3.5.5.1 在无菌条件下，灭菌移液管吸取1mL样品，沿试管壁缓缓注入含有 9ml灭菌生理盐水的试管中，震摇试管，混合均匀，做成1:10的样 品稀释液。另取一支含有9ml生理盐水的灭菌试管，移取1ml的1:10 试液于其灭菌试管中，做10倍递增样品稀释液。另外，用此法做出 1:1000的样品稀释液。 1.3.5.5.2 根据食品卫生标准要求或对检验污染情况的估计，选择2,3个适宜 样品稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该样品稀释 液的吸管移1ml样品稀释液于灭菌平皿内，每个样品稀释度做两个平 皿。 1.3.5.5.3取一空的灭菌培养皿，移取1ml灭菌生理盐水，倾注肉膏蛋白胨琼脂 培养基，培养基的量为培养基高度的1/3,作空白对照。 1.3.5.5.4用1ml灭菌移液管取1:10的样品试液于平皿，倾注溶化并冷却到45? 左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的1/3,并 立即在桌上作平面旋摇，使牛奶样液和培养基混匀。 另取1ml灭菌移液管取1:100的样品试液于平皿，倾注溶化并冷却到 45?左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的1/3, 并立即在桌上作平面旋摇，使牛奶样液和培养基混匀。 再取1ml灭菌移液管取1:1000的样品试液于平皿，倾注溶化并冷却 到45?左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的 1/3,并立即在桌上作平面旋摇，使牛奶样液和培养基混匀。 1.3.5.5.5 待培养基凝固后，倒置于37?温箱中，培养48h，进行菌落计数。 2 结果与分析 2.1 结果 2.1.1 菌落照片 -1生牛奶 稀释度10 -2生牛奶 稀释度10 -3生牛奶 稀释度10 -1微波中低火两分钟 稀释度10 -2微波中低火两分钟 稀释度10 -3 微波中低火两分钟 稀释度10 -1微波中低火三分钟 稀释度10 -2微波中低火三分钟 稀释度10 -3微波中低火三分钟 稀释度10 -1微波中低火四分钟 稀释度10 -2微波中低火四分钟 稀释度10 -3微波中低火四分钟 稀释度10 2.1.2 实验数据 测得培养皿中细菌菌落数如下表 生牛乳中菌落数表实验数据 -1-2-3稀释度 10 10 10 CFU 多不可记，47 52，多不可记 13,4 生牛乳中细菌总为:多不可记。 微波高火加热1分钟菌落数表实验数据 -1-2-3稀释度 10 10 10 CFU 0,5 0,3 0，0 微波高火加热1分钟细菌总数为:5×10?2,25(个) 微波中低火加热2分钟菌落数表实验数据 -1-2-3稀释度 10 10 10 CFU 0,4 0,0 0,0 微波中低火加热2分钟细菌总数为:4×10?2,20(个) 微波中低火加热3分钟菌落数表实验数据 -1-2-3稀释度 10 10 10 CFU 0,2 5，3 4,26 微波中低火加热3分钟菌落总数为:2×10?2,10(个) 微波中低火加热4分钟菌落数表实验数据 -1-2-3稀释度 10 10 10 CFU 0，多不可记 多不可记，22 10，0 3微波中低火加热4分钟菌落总数为:10×100?2,5×10 2.2分析 实验中对照组的生牛乳菌落数为多不可记，可见培养基和培养过程中造成了杂菌污染。处理上表中数据可知，微波加热牛奶时时间越长，温度越高，细菌越多，故，我们生活中微波加热牛乳时，应注意加热的时间不宜太久，强度不宜太强。 3讨论 在本实验中的空白对照培养基上长了细菌菌落，说明此培养基被污染了，杂菌来源可能是由于培养皿、锥形瓶、吸管等仪器灭菌不充分;灭菌后在空气中放置又落入杂菌;无菌操作技术不当，培养基倾入培养皿后没有立即加盖;配置培养基时反复升降温，使一些杂菌产生抗性等。因此，在制作培养基及培养的过程中要严格杀菌，并严格按照实验步骤认真操作，从而使得结果更加精确。本实验数据表明，结果虽在国家标准范围之内，但因对照受到污染，以至结果并不可信。 理论上，微波加热牛奶时时间越长，温度越高，细菌越多。但高火加热1分钟产生的细菌为25个，比中低火3分钟的细菌还多，由此可见，高火加热1分钟时极有可能被其他细菌污染，从而造成数据不准确。 由于牛乳中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使牛乳中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以某种培养基平板升生长出来的水中细菌总数仅是近似值。 本实验的成败在于灭菌、无菌操作技术、培养基的温度等方面是否操作正确，因此接种过程务必防止杂菌的侵入。实验过程中，倾注培养基后，培养皿在桌面上做匀速旋转，使培养基和牛乳样品充分摇匀，若没有摇匀，在培养基中可见一些菌苔。由于菌种在固体培养基上借助重力作用而形成的，所以观察到绝大多数的细菌着生在培养基表面。 所以在实验过程中应注意以下几点: (1)实验过程中要将所用仪器包括培养皿、锥形瓶、吸管等充分灭菌，操作过程中把手用酒精消毒。 (2)新鲜牛乳应冷藏于冰箱中，防止滋生其它细菌。 (3)为了避免杂菌污染，生牛乳与培养基溶解的过程一定要迅速，在空气中停留的时间越长，就越容易被污染。 (4)倒置培养基时应降温至45 ?，温度过高会烫死大肠杆菌，过低会使培养基凝固。 (5)倾注培养基后要将平皿在桌面上做匀速旋转，将培养基和牛乳样摇匀，在,8,培养基中观察时可见一些菌苔就是平皿没有摇匀的结果。 (6)培养基不能反复升降温，倾入培养皿后应立即加盖，且灭菌后不应在空气 中放置，以免杂菌混入。 ,9,(7)应在高温时在对照组中倒入培养基，否则对照组中会出现大量的菌落。 (8)数菌落时，只计数较大的菌落，太小的可忽略不计。 4 结论 (1)微波加热时间越长，温度越高，细菌越多，那么，我们生活中微波加热牛乳时，应注意加热的时间不宜太久，强度不宜太强。 (2)测定牛奶样品是否符合饮用乳类微生物方面的卫生标准，通常包括下列两项:细菌总数测定和总大肠菌群的测定。除采用平板菌落计数测定细菌总数外，现在已有许多快速、简便的微生物检测仪或试剂纸(盒或卡)等用来测定牛乳中细菌总数。 (3)影响因素 1)在数菌落时，菌落太小且又处于培养基内部这样就不能观察到菌落从而影响结果; 2)在培养过程中由于细菌之间的相互抑制也会使计数菌落减少。因此，只有在实验不需要精确的情况下才可使用此方法。虽然牛乳中存在大量的细菌且种类繁多，但由于牛肉膏蛋白胨所提供的生长条件的限制，培养基中所得的细菌群落较单一为大肠杆菌，呈圆片状。 参考文献 ,1,沈萍，范秀容等.微生物学实验(第四版).北京:高等教育出版社，2007 ,2, 陈 刘丽丽.微生物学实验研究方法北京:人民教育出版社，1982 ,3,彭珍荣主编. 现代微生物学. 武汉: 武汉大学出版社，1995:351-356 ,4, 李根生.干燥培养基恩德制造及应用.上海:上海科学技术文献出版社，1994 ,5, 郝士海.现代细菌学培养基和生化试验手册.北京:中国科学技术出版社，1992 罗雪云等.食品卫生微生物检验标准手册.北京:中国标准出版社，1995,6, ,7,沈萍主编. 微生物学. 北京:高等教育出版社，2000:54-57. ,8,赵斌,何绍江.微生物学实验. 北京:科学出版社,2000:187-192 ,9,钱存柔.微生物学实验. 北京:北京大学出版社,1985(1):201-203 ,10,沈萍,范秀容.微生物学实验. 北京:高等教育出版社,1999:196-199 ,11,周群英,高廷耀.环境微生物学.北京:高等教育出版社，1998:188-196 ( ,12,周德庆.微生物教程.北京:高等教育出版社,2005:362-368. ,13,美)R.Y.斯塔尼尔,E.R.阿德尔伯格,J.L.英格拉哈姆.微生物世界.北 京:科学出版社, 1983:452-467. ,14,英)J.尼克林,K.格雷迷- 库克,T.派吉特,R.A.基林顿.微生物学.北