参芪扶正注射液的研究（可编辑）

参芪扶正注射液的研究（可编辑） 华中科技大学 硕士学位 参芪扶正注射液研究 姓名:张锦文 申请学位级别:硕士 专业:药物化学 指导教师:吴继洲;张勇慧 20080501独创性声明 本人郑重声明,本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果的总结。尽我所知,除文中已经标明引用的内容外,本论文不包含任何 其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人 和集 体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的 一切 法律后果。 学位论文作者签名: 日期: 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即:学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被 查阅 和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密?,在 年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密?。 (请在以上方框内打“?”) 学位论文作者签名: 指导教师签名: 日期: 年 月 日 日期: 年 月 日华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 中文摘要 参芪扶正注射液是用黄芪、党参制成的静脉输液制剂,具有扶正固本、益气 补虚、活血化瘀的功效。参芪扶正注射液是首家批准上市的纯中药澄明大输液, 不仅是肿瘤患者理想的保护造血系统功能、改善免疫功能及生活质量的辅助治疗 药物,而且是冠心病、心绞痛、中风患者较理想的治疗药物。 本研究在改良传统制剂工艺的基础上,按照处方筛选获得的最终制剂处方制 成注射用参芪扶正注射液(小水针)。根据药品注册管理办法的规定,属于中药、 天然药物八类“改变国内已上市销售中药、天然药物剂型的制剂。” 一、工艺研究 总皂苷的提取与纯化工艺 总皂苷的提取 以总皂苷含量为指标,对乙醇浓度、用量、提取次数及提取时间进行正交试 验,确定总皂苷的最佳提取工艺为倍量的 乙醇加热回流提取次,次。验证性 试验说明工艺最优。 总皂苷的纯化 分别进行了不同吸附树脂对总皂苷的静态吸附量和对总皂苷静态吸附洗脱 性能试验,结果表明 型树脂最佳。对 树脂参芪总皂苷动态吸附性能进 行了测定,饱和吸附量为 ,动态吸附率为。对不同体积分 数乙醇及用量对黄芪总皂苷洗脱性能进行了考察,结果表明黄芪总皂苷主要 集中 在%乙醇到 %乙醇洗脱部分,因此,洗脱工艺为上样后先以蒸馏水脱杂质后, 继以 %乙醇洗脱参芪总皂苷部位,用量各为倍量树脂柱体积。验证性试验纯 化工艺最优。 总皂苷提取物干燥条件的研究 以干燥前后总皂苷重量差为指标,对干燥时间、干燥温度、干燥真空度进行 正交试验,确定干燥工艺为干燥真空度为 ,干燥温度为 ?下干燥时间 小时。验证性试验说明干燥条件最优。 总多糖的提取与纯化工艺 蒸馏水提取条件的优选 1 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 以多糖的总质量为指标对加水量、提取时间、提取温度、提取次数进行正交 实验,确定工艺为加水 倍量,提取时间 ,提取温度 ?,提取次数 次。验证性试验说明提取条件最优。 醇沉条件的优选 以多糖质量为醇沉指标,对乙醇体积分数、药液浓缩程度、静置时间进行正 交实验。确定工艺为醇沉时乙醇体积分数为,药液浓缩至 药液生药, 静置时间为小时。验证性试验说明醇沉条件最优。 总多糖提取物干燥条件的研究 以干燥前后总多糖重量差为考察指标,对干燥时间、干燥温度、干燥真空度 进行正交试验筛选,确定干燥工艺为在干燥真空度为 ,干燥温度为 ? 下干燥时间小时。验证性试验表明干燥条件最优。 制剂成型工艺 对增溶剂用量、 值、活性炭用量及灭菌工艺进行了研究,确定制剂成型 工艺:取处方量党参、黄芪总皂苷及总多糖提取物,加 注射用水使溶解, 加吐温 至其含量为 ,加聚维酮 至其含量为 ,用 氢氧化钠溶液 调 值 ~ ,补加注射用水至,加 活性炭室温下搅拌 小时,过 滤脱炭, μ 微孔滤膜精滤,灌装于 安踣瓶中,每瓶 , ?灭菌 ,即得。 二、质量研究总皂苷含量测定 照分光光度法(中国药典 年版一部附录 )测定。以 供试品溶液 中对照品的量( )为横坐标、吸收度值为纵坐标,绘制标准曲线,得线性方 程为 在 ~ 范围内线性良好。重复性实验,精密度实验 ,溶液稳定性实验,加样回收实验,三批样品总皂苷含量分别为 、 、 。 黄芪甲苷含量测定 照高效液相色谱法(中国药典 年版一部附录 )测定。十八烷基硅烷 键合硅胶为填充剂,乙腈水〔 〕为流动相,蒸发光散射( )检测器。 以浓度的对数值为横坐标,峰面积的对数值为纵坐标进行线性回归,得回归方程 2 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 为: , ,表明进样量浓度的对数值在 ~ / 内与峰面积积分值的对数值之间呈良好的线性关系。重复性实验,精密度实验 ,溶液稳定性实验 ,加样回收实验,三批样品黄芪甲苷含量分别为 、 、 。 多糖含量测定 以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,得线性回归方程为 , 。重复性实验,精密度实验,溶液稳定性实验 ,加样回收实验 ,三批样品多糖含量分别为 、、。 在几种输液中的稳定性试验 对本品在生理盐水及 葡萄糖注射液中的稳定性进行了研究, 小时后观察 结果,溶液无色澄明,无沉淀,变色等现象,总皂苷、黄芪甲苷和多糖含量无明 显变化。说明本品与临床常规注射溶液无明显配伍禁忌。 三、稳定性研究 影响因素试验 强光实验 将本品置于 ? 照度下的光橱内放置 天,结果总 皂苷、黄芪甲苷及总多糖含量略有下降,提示本品应避光保存。 高温实验 将本品置于 ???温度下放置 天,结果总皂苷、黄芪甲苷 及总多糖含量略有下降,提示本品应在?处保存。 高湿实验 将本品置于 %? 湿度下放置 天,结果各项指标均无明 显变化。 加速试验及长期试验 参芪扶正注射液在 ?, 加速试验个月,在 ?, 条件下 长期留样考察 个月,考察样品性状、澄明度、 值、水分、蛋白质、鞣质、 炽灼残渣、不溶性微粒、重金属、砷盐、树脂及总皂苷、黄芪甲苷、总多糖 含 量等指标,结果各项指标均符合规定。根据上述结果,本品有效期暂定为一年 半。 关键词 参芪扶正注射液,工艺研究,质量标准,稳定性研究 3 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 ABSTRACT ShenQiFuZheng Injection consists of Astragalus mongholicus and Codonopsis pilosula with Astragaloside IV, astragalus polysaccharides, codonopsis saponin and codonopsis polysaccharides as its active components. According to their physico-chemical properties, the method for separation and purification of these active components were studied: the saponins were extracted by alcohol and purified by macroporous resin; the polysaccharides in gruffs were extracted by water and purified by fractional precipitation and ultrafiltrationWith the improvement of traditional praeparatum technique, the ShenQiFuZheng Injection10mL was obtained on the basis of optimization prescription. Moreover, in order to guarantee the stabilization and control of the injection, the quality specification was also studied in this researchStudy on Process1 Study on Extract and purify of total saponins 1.1 Study on Extract of total saponins The index is the content of total saponins, undertaking orthogonal experiment for alcohol density, dosage, extract frequency and extract time, determined the best extract technology of total saponins was six times quantitative 70% alcohol warm up then recirculate three times, every time for 90 minutes. The proving test explained the optimization process1.2 Study on Purify of total saponins Undertaking experiments at different polymeric adsorbent to quiet state adsorption quantity of total saponins and to quiet state adsorption-elution efficiencyThe consequence indicate that the type of D-101 resin is the optimization. In progress determination to the dynamic state adsorb disposition of ShenQi total saponins, saturate adsorption quantity was 240.3 mg, dynamic state adsorption rate was 10.78 mg/ml. In progress consideration to different volume fraction alcohol and4华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 dosis of Astragalus mongholicus con-saponin, the consequence indicate that Astragalus mongholicus total saponins major concentrate between 20% to 80% alcohol elute fractionAccordingly, the elute technology was using distilled water to get out of foreign matter, firstly after ascend essay, followed by 80% alcohol to elute ShenQi con-saponin location, with each dosage 4 times quantity of resin column volume. The proving test explained the best depurate technology1.3 Drying process study on the total saponins The index was the total saponin weight substraction before and after drying undertaking orthogonal experiment for drying time, drying temperature, drying degree of vacuum, ;determin the drying technology is drying time for 6 hours with drying degree vacuum 0.06 Mpa, drying temperature 60?. the proving test was explaining the best drying qualification2. Study on Extract and purify of total polysaccharides 2.1 Optimization of distilled water extraction The index was the polysaccharide total weight,undertaking orthogonal experiment for imbitition quantity; extract time, extract temperature, extract frequency, determined the technology was imbitition distilled water 10 times, extract time 1.5 hours, extract temperature 60 ?, extract frequency 2 times. The confirmatory experiment showed that distilled water extraction was the best2.2 Optimization of alcohol precipitation The index was the polysaccharide weight, undertaking orthogonal experiment on alcohol volume fraction, physic liquor concentrate degree, standing time. Determined the technology is 70% alcohol volume fraction, physic liquor concentrate degree to 4 mL physic liquor/g crude drug, with 24 hours standing time. The confirmatory experiment shows that alcohol precipitation was the best2.3 Optimization of total polysaccharides drying The index was the total polysaccharide weight substraction before and after drying, undertaking orthogonal experiment on drying time, drying temperature, drying5华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 degree of vacuum, determin the drying technology is drying time for 4 hours with drying degree vacuum 0.07 Mpa, drying temperature 60?. the confirmatory experiment shows that dryingwasthe best3.Study on preparation process Based on solubilizing agent dosis, pH value, activated carbon dosis and sterilization technology study, to decide the modeling technology of preparation: formula quantities of Codonopsis pilosula, astragali radix total saponins and total polysaccharides extraction, added 9000 ml aqua pro injectione in order to haemolyze, add tween-80 to 0.5% content, added polyvidone K30 to 0.5% content, used 10% NaOH solution to shift 6.5-7.5 PH value, patch aqua pro injectione to 10000ml, added 0.5% active carbon and agitate 1 hour at room temperature. Filtering to break away active carbon, used 0.22?m microporous membrane to fineness filter, pour in 10ml bottle , each 10ml, sterilization 60 min at 100?Quality Investigation 1.Total saponin assay According to absorption spectrometry China Pharmacopeia 2005 edition one department of supplement VA to determine. Using the quantity of control article in 0.5 m1 test solution as abscissa, the value of absorbability as ordinate, drawing standard curve, obtaining the linear equation was Y3.56X-0.0096,R0.9987, within 0~0.20mg circumsciption linearity was fine. The RSD value of reproducibility experiment was 1.56%, precision experiment was 0.93%, solution stability experiment was 1.11%, spotting and reclaiming experiment was 1.14%, the content of three batchs sample product is 16.5mg、18.6 mg、19.3 mg, respectively2. Astragali,radix onycho-glycoside assay According to high-performance liquid chromatography China Pharmacopeia 2005 edition one department of supplement VI D to determine. Using octadecylsilane chemically bonded silica as bulking agent, methyl cyanide-aquafer〔35: 65〕 as moving phase, evaporation light scattering detector(ELSD). Using the logarithm value ofconcentration as abscissa , the logarithm value of peak area as ordinate to carry out6华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 linear regression, obtaining the linear equation is Y1.3184X+6.7165,R0.9984, indicate that the logarithm value of sample size concentration within 0.0114~0.1425 mg/mL together with the logarithm value of peak area score are having satisfactory linear relationship.The RSD values of reproducibility experiment was 0.86%, precision experiment was 1.90%, solution stability experiment was 1.23%, spotting and reclaiming experiment was 1.35%, the content of three batchs sample product was 0.71 mg、0.66 mg、0.70 mg, respectively3.Polysaccharides assay Using the concentration as abscissa, the absorbance as ordinate to carry out linear regression, obtaining the linear equation was Y13.738X-0.0578,R0.9993, The RSD values of reproducibility experiment was 1.03%, precision experiment was 0.91%, solution stability experiment was 0.89%, spotting and reclaiming experiment was 0.77%, the contentof three batchs sample product was 30.2 mg、 29.6 mg、29.8 mg , respectively4. Stability test on some kinds of transfusion Doing stability research on liquor natrii chloridi isotonicus and 5% Glucose, observe consequence after 8 hours, solution is colorless and clear limpid, without sediment, allochromasiaAnd so on. Total saponins, astragali, radix onycho-glycoside and polysaccharide contents have not obviously change. Explained that the origin article with clinical routine inject solution have not obviously chemical incompatibilityStudy on stability 1. Influencing factors experiment 1.1 Highlight experimentThe injections was taken in light closet cabinet of 45001x?5001x illumination intensity 10 days, the result was total saponins, astragali, radix onycho-glycoside and polysaccharide contents had lower a little, hint that the origin article should place away from light1.2 High temperature test7华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文The injections was taken in temperature of 60??2? 10 days, the result was total saponins, astragali, radix onycho-glycoside and polysaccharides contents had lower a little , hint that the origin article should conserve in cold or cool places1.3 High wet testThe injections was taken in humidity of RH90%?5% 10 days,the resultis each item has not obviously change2.Accelerated test and long term test ShenQiFuZheng Injection were keeped in the condition of 40 ? for 6 months, RH 90%, in the condition of 25 ?,RH 60% for 12 months, to inspect the characters of ample product, consist of clarity, pH value, moisture content, proteins, tannins, ignited residues,particulate matter, heavy metal, arsenic salt, resin and total saponins, astragali, radix onycho-glycoside and polysaccharide contents and so on, consequence showed that each item consistent with regulation ut supra result, the expiration date of origin article tentatively set on one year and an half Key words: Injection ShenQiFuZheng; Technology Investigation; Process; Quality; Stability 8华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 前 言 恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一,全世界现有癌症患者约 万, 每年有约 万新发者,防治肿瘤是世界范围内的重要课题。植物来源的抗癌制 剂占有极其重要的地位,如紫杉醇、喜树碱、长春新碱、鬼臼毒素、雷公藤内酯 等约占总抗癌药的 。 随着我国生态环境的恶化,环境污染的加重,目前恶性肿瘤的发病率还有逐 年上升的趋势,攻克癌症已成为重大的国家需求。从天然植物和传统药物中寻找 高效、低毒抗肿瘤药物一直是药学工作者致力研究的重要课题。 参芪扶正注射液是用黄芪、党参制成的静脉输液制剂。具有扶正固本、益气 补虚、活血化瘀的功效。参芪扶正注射液方中以甘温之党参扶脾养胃,补中益气 为君;用甘温之黄芪补气升阳,益气固表为臣,诸药相合,共奏补中益气,升阳 固卫之功。《珍珠囊》云:“黄芪甘温纯阳,其用有五补诸虚不足,一也;益怨气, 二也;壮脾胃,三也;去肌热,四也;排胧止痛,活血生血,内托阴疽,为疮家 圣药,五也。” 参芪扶正注射液是首家批准上市的纯中药澄明大输液,是丽珠集团制药厂与 北京中医药大学东直门医院合作开发的国家七类中药新药。长期的临床研究与实 践表明,参芪扶正注射液临床上不仅是肿瘤患者理想的保护造血系统功能、改善 免疫功能及生活质量的辅助治疗药物,而且是冠心病、心绞痛、中风患者较理想 的治疗药物,对于老弱体虚、妇女月经失调气虚、血虚症,具有广阔的临床应用 前景。参芪扶正注射液从 年上市以后,到 年实现销售近 亿元,几乎 是一年一个台阶,其中 年销售过亿。 现有抗肿瘤药物大约有 %来自于自然资源或天然化合物的衍生物。据统 计,全世界植物有 ~ 万种,美国通过 多年的抗癌筛选研究,约试验了其中 的 %,在从植物中获得的 种各类活性物质中,有抗癌活性的就有 个。中 国地域辽阔,植物资源丰富,进行过抗癌活性试验的植物数仅为% ,尚有广阔 的余地需要开发。美国在 世纪 年代,每年从植物药的生产中获得约 亿美 元的产值。特别是紫杉醇的发现,给人们从植物中寻找抗肿瘤药物极大的鼓舞。 紫杉醇是国际上九十年代抗肿瘤新药,是继阿霉素和含铂类之后最热点的抗癌 9华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 药,其独特的作用机制和高抗癌活性成为了国际肿瘤医学界关注的重点。它的发 现,不仅显著地提高了实体瘤治疗的效果,而且在上市短短几年内紫杉醇制剂的 全球销售额已突破 亿美元大关,创下单一抗癌药销量之最。 对于失去手术及放射治疗机会的晚期肿瘤,化疗无疑是一个重要手段。现有 多数药物缺乏理想的选择作用,毒性较大,特别是对机体免疫功能有不良影响。 参芪注射液有较好的增加化疗疗效的功能,能明显改善肿瘤患者的临床症状,且 能调整晚期瘤患者的免疫功能,是一种免疫增强调节剂,因此,参芪注射液是非 常理想的肿瘤免疫调节辅助治疗药物。参芪扶正注射液组方中党参和黄芪都是毒 性很低的中药,从目前的临床实践来看,参芪扶正注射液的毒副作用很小。 10华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 正 文 工艺研究 本方由黄芪和党参两味药组成,其药理活性成分主要为黄芪甲苷及黄芪多糖 和党参皂苷和党参多糖。根据这些成分理化性质,确定提取工艺为先用乙醇提取 党参黄芪中的皂苷类有效成分,并用大孔吸附树脂柱进行皂苷类成分的富集。然 后将其醇提后的药渣用水提取总多糖,并采用分级醇沉的方法富集多糖类成 分。 总皂苷的提取与纯化工艺 总皂苷的提取 取党参、黄芪饮片各 ,加一定量的乙醇加热回流提取数次,每次数小时, 合并提取液,减压回收乙醇并浓缩至相对密度 ~ ( ?)的稠膏。按 照总皂苷含量测定方法测定总皂苷含量,以总皂苷的含量为考察指标,对乙 醇浓 度、用量、提取次数及提取时间进行正交试验筛选,确定提取工艺。总皂苷 的含 量测定方法见质量研究。 表 因素水平 水平 提取次数 乙醇浓度() 乙醇用量倍 提取时间 表 正交实验结果 实验号 总皂苷含量 11 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 ? ? ?表 方差表 方差来源 离差平方和 自由度 方差估计 值 显著性 误差 极差及方差等数据的计算,可以确定总皂苷的最佳提取工艺为 ,即用 倍量的 乙醇加热回流提取次, /次。 工艺验证实验:分别取党参、黄芪饮片各 ,根据以上条件进行验证性试 验,并测定总皂苷的质量。结果如下。 表 提取工艺条件验证性试验结果 验证次数 总皂苷含量四次工艺验证试验结果说明工艺最优,三批验证试验总皂苷的含 量约 生药材,工艺基本合理。 总皂苷的纯化 将上法得到的稠膏加倍量的水溶解,静置,离心,取上清液加于已处理大 孔吸附树脂柱上,先用蒸馏水洗涤树脂柱,再用乙醇洗脱皂苷类成分,收集乙 醇 洗脱液。样品溶液的制备 称取参芪扶正总皂苷提取物含参芪总皂苷 置烧杯中,加适量蒸馏水, 充分搅拌,超声处理 ,使其充分溶解,滤过,即得。 12华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文不同吸附树脂对总皂苷的静态 吸附量试验 精密称取已处理好的干树脂约 ,置 烧杯中,加样品溶液 ,每 隔 振摇 ,持续 ,然后静置 ,使其达到饱和吸附,吸取上层液测 定参芪总皂苷的质量浓度。按下式计算树脂饱和吸附量:饱和吸附量 初始质 量浓度吸附后质量浓度×吸附液体积/树脂质量,结果见表。 表 不同吸附树脂对总皂苷的静态吸附量实验结果 树脂种类 样品液质量浓度 吸附后质量浓度 饱和吸附量(总皂苷 树脂) 不同树脂对总皂苷静态吸附洗脱性能试验 将已处理好的干树脂 ,经静态饱和吸附总皂苷后滤出,吸干表面水分,精 密加入 乙醇 ,每隔 振摇 ,持续 ,测定洗脱液的质量浓度, 计算洗脱率:洗脱率洗脱液质量浓度×洗脱液体积/饱和吸附量× , 结果见表。 表 不同树脂对总皂苷静态吸附洗脱性能试验结果 树脂种类 洗脱量 洗脱率 结果说明除 对参芪总皂苷的静态吸附量较小外,另外两种树脂的吸附量 均在 /以上,能用于参芪总皂苷的吸附分离工艺。在静态洗脱中, 型树脂吸附的参芪总皂苷较易洗脱, 型树脂的洗脱率相对较低, 型树 脂表现出最佳的综合性能。因而,选用 型树脂分离纯化参芪总皂苷。树脂对 参芪总皂苷的动态吸附性能的测定 将参芪总皂苷质量浓度为 /样品溶液分别缓慢加入装有 树脂柱 × 中,控制体积流量为 / ,每 收集个流份, 将每次所收集流份过相同的大孔树脂柱,先以 蒸馏水洗脱,继以乙醇洗脱参 芪总皂苷部位,测定乙醇洗脱部位中参芪总皂苷,绘制参芪总皂苷在 树脂柱上的动态吸附曲线,确定 树脂对参芪总皂苷的动态吸附性能, 结果见表、图。 13 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 表 树脂对参芪总皂苷的动态吸附性能的测定 流份数 参芪总皂苷浓度 流份数 参芪总皂苷浓度 系列流份 图 树脂对参芪总皂苷的动态吸附曲线 可见,从第 流份开始,参芪总皂苷出现较大量泄漏;随着流份数的增加, 参芪总皂苷质量浓度也不断上升,增至第 流份以后,曲线趋于平缓,即此时 树脂对参芪总皂苷的动态吸附趋于饱和,吸附量可达 。动态吸附 率为/ 树脂。因此考虑实际生产工艺中上样量不超过生药 / 树脂,以免造成参芪总皂苷的大量泄漏,损失得率。 不同体积分数乙醇及用量对黄芪总皂苷洗脱性能的考察 参芪提取物水溶液 参芪扶正总皂苷提取物上 树脂柱后分 别以蒸馏水及 %、 %、 %、 %乙醇各 洗脱, 收集个流 份,分别测定各洗脱液流份中参芪总皂苷的质量浓度,绘制洗脱曲线,见表、 图。 14 黄芪总皂苷 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 表 不同体积分数乙醇及用量对黄芪总皂苷洗脱性能的考察 流份数 参芪总皂苷浓度 流份数 参芪总皂苷浓度 系列 流份 图 不同体积分数乙醇及用对黄芪总皂苷洗脱性能的影响 可以看出,蒸馏水洗脱液中黄芪总皂苷很少,而主要集中在%乙醇到 %乙醇洗脱部分, %乙醇洗脱部位中参芪总皂苷也很少。因此考虑洗脱工艺为 上样后先以蒸馏水脱杂质后,继以%乙醇洗脱参芪总皂苷部位,用量各为倍 量树脂柱体积。 验证性试验 取参芪提取物 ,根据以上工艺条件进行验证性试验,并跟踪检测总皂 苷的洗脱率和总皂苷含量占总固形物的百分含量,结果见表。 表 总皂苷的纯化工艺验证性试验 验证次数 项目 总皂苷的洗脱率总皂苷含量占总固形物的百分含量 15 黄芪总皂苷华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 证实醇提后经过 树脂的精制处理,可以使参芪总皂苷的得率和总皂苷 占总固形物的百分含量均达到较高水平,达到有效部位的。 由以上实验可以确定总皂苷的纯化工艺为:将稠膏加倍量的水溶解,静置, 离心,取上清液加于已处理 大孔吸附树脂柱上,先用蒸馏水洗涤树脂柱,再 用 乙醇洗脱皂苷类成分,收集 乙醇洗脱液,减压回收乙醇浓缩至浸膏,得 总皂苷提取物。 总皂苷提取物干燥条件的研究 实验仪器是上海市精密试验设备有限公司生产的 型真空干燥箱。真 空干燥箱主要由真空系统 真空泵,真空仪表,真空干燥室 、加热系统,温度 调 节系统组成。 按照干燥前后总皂苷重量差为考察指标,分别对 总皂苷进行干燥,对 干燥时间、干燥温度、干燥真空度进行正交试验筛选,确定干燥工艺。 表 因素水平 水平 干燥时间 干燥温度? 干燥真空度 表 正交实验结果 干燥前后总皂苷重 实验号 空白 量差 16华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 ? ?? 表 方差分析表 方差来源 离差平方和 自由度 方差估计 值 显著性 误差极差及方差等数据的计算,可以确定总皂苷的最佳干燥条件为,即在 干燥真空度为 ,干燥温度为 ?下干燥时间小时。 工艺验证实验:分别取参芪总皂苷各 ,根据以上条件进行验证性试验, 并测定干燥前后总皂苷重量差 。结果如下。 表 总皂苷干燥条件验证性试验结果 验证次数 干燥前后总皂苷重量差四次工艺验证试验结果说明干燥条件最优,四批验证 试验干燥前后总皂苷重 量差 约 总皂苷生药材,干燥工艺基本合理。 总多糖的提取与纯化工艺 总多糖的提取 以总多糖的含量为考察指标,对加水量、浸提温度、浸提时间和浸提次数进 行试验筛选,确定提取工艺。总多糖的含量测定方法见质量研究。 17 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 不同提取方法比较 称取上述挥去溶剂后的药渣 党参和黄芪各 ,分别加入 / 稀盐酸溶液、 / 稀氢氧化钠溶液、蒸馏水,恒温水浴中进行浸提,离心 后取上清液,减压浓缩后加入 乙醇醇沉,离心取沉淀,将沉淀用无水乙醇、 无水乙醚、丙酮洗涤,真空冷冻干燥,得参芪多糖粗品,测定多糖的质量分数。 各自在相同的条件下重复操作 次,结果见表- 。以稀碱作为提取剂,浸提混 合物浓稠,不易离心,加入乙醇后,溶液无明显絮状沉淀,沉淀物不能被彻底离 心,所得沉淀物呈黏性半溶液状。稀酸浸提混合物也比较黏稠,所得粗多糖的质 量分数较低。可能是因为稀酸、稀碱易使多糖发生糖苷键的断裂,使部分多糖发 生水解。而采用蒸馏水作为提取剂较易操作,粗多糖的质量分数也高,故以蒸馏 水作为提取剂。 表 提取方法的比较提取剂 多糖( ) 稀 稀 蒸馏水 蒸馏水提取条件的优选 影响水提取多糖工艺的因素很多,通过预备试验选择个主要因素:加水量 、提取时间 、提取温度 、提取次数 ,每个因素各取个水平表 , 称取上述挥去溶剂后的药渣 党参和黄芪各 在平行操作下,按正交实验,以 多糖的总质量为提取效果的评价指标对水提取工艺条件进行优化, 结果见表 。对结果进行统计学处理,方差分析结果见表 。 表 因素水平 水平 加水量 提取时间 提取温度 提取次数 18华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 表 正交实验结果 实验号 多糖的总质量 ??? 表 方差分析表 方差来源 离差平方和 自由度 方差估计 值 显著性 (误差) 分析可知,以多糖的质量为评价指标,各因素对提取效果的影响程度依次为 提取时间 加水量 提取次数 提取温度,因素影响差异也有显著 性,直观分析表明多糖的质量最高的工艺为 。即加水 倍量,提取时间 ,提取温度 ?,提取次数次。 醇沉条件的优选 影响醇沉效果的主要因素有乙醇体积分数 、药液的浓缩程度 、静置时 间 。以蒸馏水为提取剂,采用水浸提最佳工艺提取多糖,以上述个因素为考 察因素,每个因素各取个水平表- ,称取上述挥去溶剂后的药渣 党 19 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 参和黄芪各,在平行操作条件下,按正交试验,以多糖的质量作 为醇沉效果的评价指标表- 。对结果进行统计学处理,得方差分析表-表 因 素水平 水平 乙醇体积分数 药液的浓缩程度 静置时间表 正交实验结果 实验号 多糖的总质量 ???20华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 表 方差分析表 方差来源 离差平方和 自由度 方差估计 值 显著性(误差) 结果分析可知,以多糖的质量为评价指标,各因素对醇沉效果的影响程度依 次为 乙醇体积分数 药液浓缩程度 静置时间, 因素影响差异有高度 显著性,因素影响差异有显著性,直观分析表明多糖的质量分数最高的工艺 为 。即醇沉时乙醇体积分数为,药液浓缩至 药液/生药,静置时间 为小时。 验证试验:据筛选所得最佳提取工艺 和最佳醇沉工艺 ,进行正交验证试验, 得粗多糖质量平均为 / 生药 党参和黄芪各 。 表 总多糖的纯化工艺验证性试验 验证次数 项目 多糖质量 总多糖提取物干燥条件的研究 实验仪器是上海市精密试验设备有限公司生产的 型真空干燥箱。真 空干燥箱主要由真空系统 真空泵,真空仪表,真空干燥室 、加热系统,温度 调 节系统组成。 按照干燥前后总多糖重量差为考察指标,分别对 总多糖进行干燥,对 干燥时间、干燥温度、干燥真空度进行正交试验筛选,确定干燥工艺。 表 因素水平 水平 干燥时间 干燥温度? 干燥真空度21华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 表 正交实验结果 干燥前后总多糖重 实验号 空白 量差 ? ?? 表 方差分析表 方差来源 离差平方和 自由度 方差估计 值 显著性 误差极差及方差等数据的计算,可以确定总多糖的最佳干燥条件为,即在 干燥真空度为 ,干燥温度为 ?下干燥时间小时。 工艺验证实验:分别取参芪总多糖各 ,根据以上条件进行验证性试验, 22 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 并测定干燥前后总皂苷重量差 。结果如下。 表 总多糖干燥条件验证性试验结果 验证次数 干燥前后总多糖重量差四次工艺验证试验结果说明干燥条件最优,四批验证 试验干燥前后总多糖重 量差 约 总多糖生药材,干燥工艺基本合理。 制剂成型工艺 增溶剂用量 处方 党参、黄芪 各 注射用水 制成 支 党参、黄芪各 ,按上述提取纯化工艺分别制得总皂苷及总多糖提取物, 加注射用水 ,分别加不同体积比聚维酮 及吐温 ,补加注射用水至,检察产 品澄明度的稳定性。 表 处方筛选的组方 以每 支含量为单位 处方 药材量 注射用水 增溶剂用量 澄明度稳定性 处方党参、黄芪各聚维酮 不稳定 处方 党参、黄芪各 聚维酮 不稳定 处方 党参、黄芪各聚维酮 不稳定 处方 党参、黄芪各吐温 不稳定 处方 党参、黄芪各 吐温 不稳定 处方 党参、黄芪各吐温 不稳定 处方 党参、黄芪各吐温 及 聚维酮 稳定 处方 党参、黄芪各吐温 及 聚维酮 稳定 上述结果表明:处方及处方可以使产品澄明度稳定性达到要求,考虑到辅 料的用量,采用处方,即加 吐温 及 聚维酮 ,可以使样品的澄明 度稳定性达到要求。值考察 23 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 处方 党参、黄芪 各 注射用水 制成 支 党参、黄芪各 ,按上述提取纯