酶消化法分离培养小鼠胎儿成纤维细胞

酶消化法分离培养小鼠胎儿成纤维细胞 酶消化法分离培养小鼠胎儿成纤维细胞 一( 实验目的 掌握消化分离培养小鼠胎儿成纤维细胞的基本方法及原理。 二( 实验原理 胰蛋白酶消化液包括胰蛋白酶和EDTA。胰蛋白酶是一种消化酶，它通过作用于精氨酸或赖氨酸之间的肽键，能破坏细胞间的连接，进而从组织块中分离获得单个细胞;细胞之间是通过CAM(细胞粘性分子)相连，而很多粘性分子只有在+2价金属离子，如Ca2+、Mg2+的存在下，才能行驶这种功能，在胰蛋白酶中加EDTA的作用是熬合这些二价离子，使细胞被消成单细胞状态;本实验就是采用胰蛋白酶和EDTA消化小鼠胎儿肌肉组织获得单个细胞。 实验器材 试剂:10%犊牛血清(NBS)的1640培养液，0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA， ) PBS(一 离心机，滴管，普通天平，手术器械，载玻片，离心管等 器械: 材料:怀孕小鼠13.5天母鼠 三( 实验步骤 1(取材:断颈处死孕鼠，腹部向上置于解剖盘中。碘酒消毒1-2次，75%酒精脱碘。剪开腹壁，更换手术器械，取胎儿置培养皿中。 2(剔除和清洗:从子宫中挤出胎儿，剪去胎儿头、尾、四肢、内脏和脊柱后，反复用PBS冲洗3-4次。 33(剪碎:将冲洗干净后的胎儿组织块置另一培养皿中，剪碎至1 mm。 4(消化:加入4mL0.25%胰蛋白酶消化液，37?消化5-7min。 5(终止:加入4ml含10%NBS的1640培养液终止消化。 6(收集细胞:离心用100目滤沙将细胞悬液过滤至离心管中，平衡，离心(1000rpm，5min)。 7(制备细胞悬液:弃上清，加入1ml含10%NBS的1640培养液，吹打成细胞悬液。 8(细胞形态观察:取载玻片一张，滴细胞悬液一滴，盖上盖玻片，显微镜下观察。 9(细胞计数:按照上一实验介绍方法计数。 510(培养细胞:将稀释至1×10个/ML细胞悬液加入培养皿或培养瓶，置于5%CO2,37?，75%湿度培养中培养。 五(作业 1(观察小鼠胎儿成纤维细胞 2(撰写实验报告 实验结果的看法分析: 1. 短颈处死孕鼠，无菌操作取出胎儿 32. 剪碎胎儿组织至1mm 3. 掌握培养小鼠胎儿成纤维细胞的步骤和方法