HNE和Fenton合剂对晶状体上皮细胞骨骼的作用

HNE和Fenton合剂对晶状体上皮细胞骨骼的作用 HNE和Fenton合剂对晶状体上皮细胞骨骼 的作用 眼科研究2005年8月第23卷第4期?373 ? 实验研究? HNE和Fenton合剂对晶状体上皮细胞骨骼的作用 肖天林蒋幼芹NaseemH.Ansari EffectofHNEandFentonreagentsonthecytoskeletonoflensepithelialcell XiaoTianlin,JiangYouqin,NaseemH.Ansari.DepartmentofOphthalmology,SecondHospitalofXiangya MedicalCollege,Center—southUniversity,Changsha41001J,China Abstract0bjectiveToinvestigatethe4-hydr0yn0nenal(HNE)andFentonreagentinducedearlyeytoskeletonchanges ofhumanlensepithelialcells(HLECs)andratlensepithelia.MethodsHLECslinewereisolatedandsubcuhuredinDMEM mediumwith20%fetalbovineserumand20~g/mlgentamiein.andgeneration20— 30ofHLECswerecollectedforthis experiment.RatlensweretreatedwithHNEandFentonreagents.ApoptosisofHLECswasdeterminedusingcelldeathdetection ELISAKit.Theopacityofratlenswasobservedusingimagesystem.Antibodiesofanti— cytoskeletonsuchasanti—tubulin,actinand vlmentinwereappliedfortheimmunohistochemicalstainingandWesternblotanalysisinHLECsandratlensepithelia.Results HNEmediatedapoptosisofHLECsat1hourandgotitshighestlevelat2hours.However, Fentonreagentsresultedinapoptosisat 4hourswithitspeakat24hours.80%ofcellsdeathoccurredat4hoursinHNEand27%at8hoursinFent0nreagents. OpacityofratlenswasgraduallyincreasedduringtheincubationcoursewithHNEandfentonr eagents.AfterexposuretoHNEand Fentonreagents,HLECsshrunkandtransformedintoroundshapewiththelossofcytoskeleto nanditsnetworks.Immunoreactive bandsofvimentin,tubulinandaetinweredecreasedindifferenttimepoints.Disorderofcytos keletonsoftheratlenseDitheliaand decreaseofstainingintensityoftubulinandaetinweredetected.ConclusionHNEandFentoni nduceHLECsapoptosisand formationofratcataract.Lenscytoskeletonmayplayaroleingenesisofcataract. Keywordslensepithelium;cytoskeleton;HNE;Fentonreagents 摘要目的研究HNE和Fenton合剂对人品状体上皮细胞株(HLEC)和大鼠晶状体 的细胞骨骼的早期改变.以了 解这些改变在白内障发生中的作用.HLEC及大鼠晶状体经HNE,Fenton合剂 处理,使用试剂盒测定细胞凋亡. 观察和记录白内障的变化;加抗肌动蛋白,vimentin和微管蛋白抗体进行免疫组织 化学及WesternBlot.结果 HNE诱导HLEC细胞凋亡发生在接触后lh,2,4h最为明显;Fenton合剂迟至4h 发生,48h达高峰.HNE和Fent0n合 剂均能引起大鼠晶状体混浊,并随时间延长而加剧.接触HNE和Fenton合剂 后,HLEC细胞变团和皱缩,细胞骨骼丢失 明显;肌动蛋白,vimentin和微管蛋白随时间延长而减少;大鼠晶状体皮质和核的这 三种细胞骨骼几乎均有明显下降甚至 消失.结论HNE和Fenton合剂可致晶状体上皮细胞凋亡及白内障形成,该结果与 细胞骨骼的损伤和丢失密切相关, 脂质过氧化引起的细胞骨骼的损伤可能在白内障形成过程中起一定的作用. 关键词晶状体上皮;细胞骨骼;HNE;Fenton合剂 分类号R776文章标识码A文章编号l003—0808(2005)04一o37304 研究明脂质过氧化物引起的损伤可能涉及老年 性和糖尿病性白内障.脂质过氧化的产物之一,4一 hydroxynonenal(HNE)是一种多链未饱和脂肪酸(n-6) 的降解产物,且是一种非常活跃的对组织细胞有高 毒性的产物….Fenton合剂也是一种强氧化合剂 作者单位:410000长沙市爱尔眼科医院(肖天林,蒋幼芹): DepartmentofHumanBiologicalChemistryandGenetics, UniversityofTexas MedicalBranch77550,USA410015(NaseemH.Ansari) 通讯作者:肖天林(Email:tlxiao@yahoo.com) 局部接触HNE和Fenton合剂后,晶状体上皮细胞是 阻挡这些有害毒素的第一道屏障,其中的细胞骨骼 (cytoskeleton)在维持和保护晶状体的结构和功能中起 着非常重要的作用.有报道神经元微管蛋白,纤维 母细胞和心肌细胞的细胞骨骼在接触HNE后发生改 变;在动物和人的白内障模型中,细胞骨骼减少和 破裂.我们使用HNE和Fenton合剂,在人晶状体 上皮细胞株(humanlensepithelialcell,HLEC)和大鼠 晶状体诱导细胞凋亡和白内障,以了解脂质过氧化引 起的晶状体细胞骨骼的改变在白内障发生中的作用. 1材料与方法 1.1细胞培养及HNE和Fenton合剂处理 HLEC(来自WashingtonStateUniversity,St.Louis) 使用DMEM加20%FBS作为培养基,实验选用20,23 代的细胞.l2孑L培养板每孑L植入0.1×10.HLEC细 胞,24h后加40~mol/L的HNE(CaymanChemical, MI)和Fenton合剂(100~mol/L硫酸胺铁,lO0~mol/L 过氧化氢;2mmol/L二磷酸腺苷酸ADP,Sigma,St. Luois).1,2,4,8,24和48h后获取细胞. 1.2细胞凋亡实验 经HNE和Fenton合剂处理的HLEC按照细胞凋 亡试剂盒(BoehehringerMannheim,Switzerland)说明行 ELISA实验.此试剂可定量测定细胞凋亡发生后组蛋 白相关的DNA片段.在这个反应中,抗原是来自 5000个细胞的胞浆成分,抗组蛋白一抗被吸附到微滴 定的孑L板面上,抗DNA的二抗带有过氧化物酶.使用 Vmax动态微板读数仪(MolecularDevicesCorporation, CA)记录405nm的吸收变化. 1.3大鼠晶状体培养及白内障的观察 正常SpragueDawley鼠品状体置于l2孑L培养板, 使用M199培养基,分别加50~mol/LHNE及Fenton 合剂(浓度同上),每日换培养基及试剂,用Alpha imagesystem(AlphaInnotechCorporation,CA)观察和 记录白内障的变化. 1.4HLEC的免疫组织化学 2em的盖玻片置于6孑L的培养板中,每孑L加0.1 ×10.HLEC细胞,24h后加40~mol/L的HNE和 Fenton合剂(浓度同前),HNE处理的盖玻片在30min 后取出,其他的则在4h后取出.玻片固定后用含1% Triton的TBS洗3次,加肌动蛋白(SantaCruz Biotechnology,CA),vimentin和微管蛋白抗体(Sigma, St.Louis)4oC下反应过夜;IgG-FITC二抗室温下作用 45min,共焦显微镜下观察照相(Zeiss,LMS.510,NY). 1.5HLEC和鼠眼晶状体的WesternBlot 计数不同时间HNE和Fenton合剂处理的HLEC, 分别加100lTris缓冲液(50~mol/LTris,5mmol/L EDTA,2mmol/LPMSF);2个晶状体上皮和1个晶状 体皮质及核分别加100和500的Tris缓冲液;进 行超声裂解及粉粹,离心并收集上清夜.25g的 HLEC和晶状体(包括晶状体上皮,皮质及核)标本 12%的SDS-PAGE胶,将蛋白转到硝化纤维膜上.加 1:2000稀释的肌动蛋白,vimentin及微管蛋白抗体 4?下振荡过夜.l:3000稀释的IgG-HRP室温下作 用45min.化学发光过氧化物酶底物(ECL,Amersham Biosciences)显影及胶片曝光. 2结果 2.1HLEC的细胞凋亡 HNE和Fenton合剂诱导细胞凋亡呈时间相关性. HNE诱导细胞凋亡早在接触后lh发生,2,4h最明 显,而Fenton合剂迟至4h发生,48h达高峰.HNE和 Fenton合剂在导致细胞活性比率上也有差异:HNE在 4h导致80%以上的细胞死亡,而Fenton合剂在8h仅 致27%的细胞死亡(图1). HNE—V 3.5—x—Fent0n—V 3—?一HNE—E 2.5{+E — = 1.5 1{ 0.5, 0 1248l624 t/h 图l40pmol/LHNE和Fenton合剂处理的HLECs细胞在 l,2,4,8,24和48h的细胞活性和凋亡结果细胞凋亡随时间 增加而加重.细胞活性(Viability,V):(活细胞数?对照组细胞总 数)X100%增强子(EnrichmentFactor,E)=样本的吸光率 (10.)?相应对照的吸光率(10.) Fig.1ViabilityandapoptosisofHLECstreatedwith40p.mol/L HNEandFentonReagentsafterl,2,4,8,24and48hoursCell viability(V)=(1ivecellnumber?controlcellnumber)×100%. EnrichmentFactor(E)absorbanceofsample?absorbanceofthe correspondingcontrol 2.2晶状体透明性 在使用HNE,Fenton合剂后大鼠晶状体逐渐变混 浊,随时间的增加而加剧.3d后的图片显示有明显混 浊,晶状体混浊从皮质开始到整个晶状体(图2). 2.3HLEC细胞骨骼的免疫荧光染色 正常HLEC有明显的vimentin和微管蛋白的免疫 荧光染色,由细胞的中央向周边呈放射网状结构.使 用HNE及Fenton合剂后,HLEC细胞变圆和皱缩,网 状结构消失,抗vimentin和抗微管蛋白荧光染色不均 匀且紊乱(图3). 2.4HLEC和鼠晶状体的WesternBlot HNE处理的HLEC的肌动蛋白和vlmentin随时间 的增加而减少,尤其8h和16h减少明显,微管蛋白 4h有显着减少,而Fenton合剂组仅vimentin有减少 ??加?舳?加加0 一IU0.JU一^】【Il^【^I1|】 目250lunl~lIHNE?Fntll?台剂处后3d的大鼠晶 壮体川'M1llJ,r,IIl,"III,?Iqlf …lLf十一卜1I?l?Il_?iH…JIIJI___jr ^llIL.I1?}1H-…1 ?2lr|_rl1IIi,IIillI.iIi…ilIl50J…IIIIN 11iilJI'riI…1?if{IIl'riiHiLI1II'I|l'…r-IIi….,lilfclIrl IIiI1?ll【1…IIrli?…iIrI_?J…II?,1I…iI…{ 'rn,Irl"IrhnFI…-?【IINII?I…_…iII'I"f…J{lII ?ltvl'i_J l【皇J4)FI\让?0l轼l?,.川【动省IJl微柏. 【l近洲发.1h?【什刊j的l1状伴l应.?利c 细l地档I无『H的f洋仃趣的是IIN和 -It1)ll台刺址的.『?怵皮质惴攫I』I』L 仃IIII【【,洋嚏消f5) 讨论 I:…?等搬墟IILEC细胞.IlN的11)5(1九 约址30……一j,1.细胞州I,I1IlNE他I一2h Ibll1高JltA,Ili川1I系统定壁舒析HF 畴甘n0ljt体浊IJmIIH:培养的}'l 体35H—I的圯-盎率仆"l减少43t*6qf 目3共焦显措镜下l|JE【免癌萤光染色fx4IFjllIl*.II{【 v_?……=-I,II…r…I'_?一IIINI"IPll1_』III?l-IIn_m?ji'l~j III?IIIIiftl?iII『n1??fIIJ. ?I?IIIII…-liIpl+,1i}--fIII?iiIkIi?IIiIlI?I('I.1'I:I1.I}1j.IilI…1【I ,iHiII…I{IIIh.lii.rlIj)Iv?III1i?i1rl_rI.x4ll】1…1.I1n…rIhIIJr I'…??【…Ii?.1III,I|-…lI…IiIrIIIhI-iI?I-'LII,I…rl.trlI…Ir 一??'--一 一 -一_---一一- 圈4tlLECs细胞骨骼的%%esternBhflllNE引起细胞 骨骼的减少呈时间相关性?:lllII…Jm『 【lI】?】JJI:J……ul?…【,『'l…I?HI '41l…?}f1:?_lnmII…?')I?I【:1Ll n…hl ?4W?_…III1lillJ,…|l~llll…Illl{ll 5…m).IIIII…IlI?I'l-I?.42?c}"III{IIl1.ILI}_【|I1n(…】 Il】{}())…1IJ??1r.1……-4'J1l川?iII1iI II1IN}J?11…}IH?II{一Ir,I—I,}hI】?…I…{II,II,l 7也n……nI鸯 IllE【.邹I'H内障的推l盟我 ?的研究【JIIJJIIN【舜HIFI:搁 I餐r性剌一I-1h.【?l?n?报 道竹撤:计I1次衷叫F…-?台剂 llI,圳帆亡醴门障细 胞桐4h发.|刊顺峰; h…_J_-舟制的!'Ill胞捌I峰爱【E HF『岛谴现钍的l1J能解释足南丁 II,Fc露的圳胞搁liI.剧烈.细胞 诎}…r堑J/:.II'll?ill(…台利 世1删I—I!i持续l正0 H,f一体料培养IINr ?rlh~[i台刊【对呐ljI障儿r1叫埕 (3-I) 接触卜ff1…r制后. I'"'…ch{I"? M…ll】II_h?h,, 一 体 晶状体的细胞骨骼早期即可发生变化.免疫荧光结果 显示,在HLEC细胞株,接触HNE后30min的细胞骨 骼发生明显的损伤,如细胞皱缩,网状结构破裂或消 失;Fenton合剂引起的HLEC的损伤不如HNE引起的 迅速和严重,但4h后也有细胞变圆,网状结构紊乱. WesternBlot结果显示HNE处理的HLEC的肌动蛋白 和vimentin减少甚至消失,呈时间相关性,而Fenton合 剂处理的其vimentin也有明显减少;HNE处理的鼠晶 状体上皮的肌动蛋白和微管蛋白近乎消失;结果显示 离体的细胞株与大鼠活体的晶状体上皮的细胞骨骼对 HNE损伤的反应有不同:在HLEC,损伤由重至轻排列 是:vimentin一肌动蛋白一微管蛋白,而在大鼠晶状体 上皮为:微管蛋白一肌动蛋白一vimentin,结果正好相 反.三种细胞骨骼对来自毒素的损伤敏感性不同的原 afferty等使用uV照射兔晶状体,因尚不清楚.R结果 微管蛋白对UVA最为敏感,其次为肌动蛋白,vimentin 最难受损,这与我们的活体结果相同,我们推测是 否活体与离体的细胞骨骼的位置和暴露部位有不同. 有趣的是HNE和Fenton合剂都引起三种晶状体皮质 的细胞骨骼明显减少甚至消失,提示晶状体皮质的纤 维细胞的细胞骨骼对来自脂质过氧化的损伤更为敏感 和脆弱.这也许是为什么临床上皮质性白内障的发生 更为常见的原因. 一 些研究报道细胞骨骼的破裂与白内障的形成有 关.Mikuni等使用秋水仙碱诱导白内障,第2d晶状 体上皮和皮质的微管蛋白消失.Beck等使用 Mibefradil,一种T型钙通道抑制剂,发现肌动蛋白和 vimentin有明显的破坏.Matsushima用抗白内障药 Pantethine证明可抑制细胞骨骼蛋白的丢失.我们 的结果表明HNE处理的HLEC细胞凋亡呈时间相关 性,细胞凋亡随时间延长而加重,细胞骨骼丢失增多. 在白内障形成后的晶状体上皮和皮质,发现有微管蛋 白和肌动蛋白减少或消失,尤其是在晶状体皮质,所有 的三种细胞骨骼近乎消失或明显减少,由此也说明细 胞骨骼的丢失与白内障的形成有关. 使用HNE和Fenton合剂导致的细胞凋亡和白内 障可能与其在组织细胞的生化反应有关.HNE有一 个高度不稳定的C=C键及醛基组(C=O),它们可自 发地与一些氨基酸形成Michael产物及Schiffbase;其 结果引起选择性的细胞信息改变,DNA和蛋白质损 伤.Fenton合剂利用铁与氧产生更为毒性的氧代谢 产物,通过Fe+H,0一OH这一途径发挥作用, 此外,ADP可加剧OH一的形成.由于Fenton合剂间 接诱导HNE,它表现为迟发反应,但一旦发生,就会产 生瀑布样的放大作用.H,O,和HO一在晶状体的堆积 可能与白内障的形成有关. 由此结果表明HNE和Fenton合剂可导致晶状体 而细胞凋亡和白内障的 上皮细胞凋亡及白内障形成, 形成与细胞骨骼的损伤和丢失密切相关.由于晶状体 皮质纤维细胞的细胞骨骼比晶状体上皮细胞更为脆 弱,所以皮质更易受到毒素的攻击.如何保护细胞骨 骼免受毒素的侵袭,是我们将来研究预防白内障形成 的一个值得注意的领域. 参考文献 (收稿:2004—11—18修同:2005—04—09) (本文编辑:高红) 一一一一一一一一一一一,,一螂,一一一一,一一