[训练]丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌体外混合培养对肠道致病菌的影响

[训练]丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌体外混合培养对肠道致病菌的影响 丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌体外混合培养对肠道致病菌的影响 [摘要] 本试验研究了丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌混合培养对肠道中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌 、产气荚膜梭菌和大肠杆菌4种致病菌的影响。结果明:丁酸梭菌对这4种菌均有明显的抑制作用，可使其菌落数下降3,5个数量级;鼠李糖乳杆菌可降低产气荚膜梭菌、沙门氏 ,4个数量级。 菌菌落数;丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌混合培养可使4种致病菌菌落数均下降3 由此可见，两种菌混合培养对 4 种病原微生物的抑制无协同作用。 [关键词] 丁酸梭菌;鼠李糖乳杆菌;混合培养;肠道致病菌 [Abstract] This experiment was conducted to study the effects of the mixed culture of Clostridium butyricum and Lac- tobacillus rhamnosus on intestinal pathogens，including Salmonella gallinarum，Staphylococcus aureus，Clostridium perfrin- gens and Escherichia coli.The results showed that:the Clostridium butyricum significantly inhibited the number of these four types of bacteria and made them down 3 , 5 orders of magnitude;Lactobacillus rhamnosus reduced Clostridium per- fringens，Salmonella gallinarum colonies;the mixed culture of Clostridium butyricum and Lactobacillus rhamnosus made four kinds of bacteria down 3 , 4 orders of magnitude.The results indicated that the mixed culture of strains had no syner- gistic inhibition effect on the four kinds of pathogenic microorganisms. [Key words] Clostridium butyricum;Lactobacillus rhamnosus;mixed culture;enteric pathogens 丁酸梭菌属于梭菌属， 是一种专性厌氧的革 兰氏阳性芽孢杆菌，其广泛分布于土壤，也能从 健康动物的肠道中分离出来。 丁酸梭菌适合动物 的肠道厌氧环境(呼慧娟等，2011)，可以控制消 化道紊乱(张晓阳等，2012)，有效抑制有害菌(曹 广添等，2012)。 鼠李糖乳杆菌属于乳杆菌，具有 较强的酸及胆碱耐受能力 (王玉华等，2008)，有 抑制有害菌的作用 (吴光伟和韩建春，2009)，具 有抗氧化活性，并且可以影响机体免疫功能。 目 前丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌均被广泛用作饲料 添加剂，本试验研究了丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌 联合培养对产气荚膜梭菌、 金黄色葡萄球菌、沙 门氏菌、大肠杆菌的抑制作用，为微生物制剂联 和使用提供理论依据。 1 材料与 1.1 试验材料 1.1.1 菌种、试剂及培养基 丁酸梭菌(Clostridi- um butyricum，HJCB998)，由浙江惠嘉生物科技有 限公司提供;鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamno- sus，ATCC7469)、 产气荚膜梭菌 (Clostridi um per- ATCC13124)， 均由广东省微生物菌种保 fringens， 藏中心提供; 大肠杆菌 C83928 (Escherichia coli C83928)、沙门氏菌 (Salmonella gallinarum，C79)、 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureaus， SHZ018)， 均由浙江大学动物科学学院研究室提 供。 琼脂、氯化钠为分析纯。 厌氧液体培养基、LB 液体培养基、LB 琼脂培养基、 强化梭菌培养基 (RCM)、DRCA 梭菌选择性培养基、 伊红美蓝培养 基(EMB)、 乳酸细菌培养基 (MRS)、BP 培养基、 HE 培养基、SC 培养基，均购自北京陆桥生物科技 有限公司。 1.1.2 主要仪器与设备 厌氧培养箱、灭菌锅、恒 温培养箱、培养皿、超净工作台、试管、接种环等。 1.2 试验方法 丁酸梭菌活化: 将冻干管保藏 1.2.1 菌种活化 菌株接种于装有梭菌液体培养基的试管中， 置于 厌氧培养基中 37 ?静止厌氧培养 48 h， 取 0.1 mL 转接装有 9.9 mL 厌氧液体培养基的试管，厌氧静 止培养 16 h。 产气荚膜梭菌及鼠李糖乳杆菌活化: 在超净 台内，取一定量的无菌水迅速加入打开的冻干管， 轻轻将菌粉混匀溶解， 然后将菌液分别转接 LB 斜面及厌氧液体培养基， 置 37 ?厌氧培养 48 h 后，取 1 环菌种接种于装有 9.9 mL 厌氧液体培养 基的试管，厌氧静止培养 16 h。 1.2.2 培养物的制备 将活化好的 0.1 mL 丁酸 梭菌、鼠李糖乳杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄 球菌、大肠杆菌、沙门氏菌分别接种于装有 9.9 mL 鼠李糖乳杆厌氧液体培养基的试管， 丁酸梭菌、 菌、 产气荚膜梭菌均于 37 ?厌氧静止培养24 h， 其余肠道致病菌普通培养 16 h，并分别计数。 1.2.3 混合培养 取 16 个装有 19.9 mL 厌氧液 体培养基的三角瓶， 将活化的菌液稀释到 10 4 , 10 5 cfu/mL，分组混合:(1)丁酸梭菌与大肠杆菌按 浓度 100?1 比例混合接种到三角瓶中;(2)鼠李糖 乳杆菌、 大肠杆菌按浓度 100?1 比例混合接种到 三角瓶中;(3)丁酸梭菌、鼠李糖乳杆菌及大肠杆 菌按浓度 100?100?1 比例接种至三角瓶中;(4)将 等量的大肠杆菌接种于三角瓶中作为对照。 随后 置厌氧培养箱中 37 ?恒温静止培养。 、4、8、12、24、 活菌计数方法:分别在培养的 0 36、48、72 h 取各组培养物样本，检测试验组与对 照组中各致病菌的数量(cfu/mL)，并与单独培养 进行对比。 采用稀释平板计数法， 将待测菌液摇 匀，每组分别取 0.1 mL 样品进行 10 倍连续稀释， 选取适当稀释度的菌悬液 0.1 mL，分别滴加在伊 红美蓝选择性培养基平板上， 每个稀释度 3 个重 复，置 37 ?培养 48 h 后，计算其菌数后取平均值 (三个平板菌落总数/3×10×稀释倍数)。 由于丁酸 梭菌、鼠李糖乳杆菌是严格厌氧菌，在有氧情况下 无法长出，计数结果为准确的致病菌菌数。 丁酸梭菌和鼠李糖乳杆菌对产气荚膜梭菌、 金黄色葡萄球菌、 沙门氏菌的体外生物拮抗作用 研究方法同上。 选用的计数培养基分别为 SC 培 养基、BP 培养基、HE 培养基。 2 结果与分析 2.1 丁酸梭菌和鼠李糖乳杆菌 对沙门氏菌 的体 外生物拮抗作用 从图 1 可以看出， 培养 12 h 时， 丁酸梭菌培养组沙门氏菌数量比沙门氏菌单 独培养有明显下降趋势， 菌落数差别达 2 个数量 级，24 h 后菌落数差别达 4 , 5 个数量级。 鼠李糖 乳杆菌对沙门氏菌的抑制作用从 24 h 开始比较 明显，菌落数差别为 1 , 2 个数量级。 丁酸梭菌与 鼠李糖乳杆菌混合培养时， 沙门氏菌菌落数从 12 h 开始明显下降 ，24 h 后菌落数差别达 3 , 4 个数量级，可见，两种菌联合培养对沙门氏菌的抑 制无协同作用。 2.2 丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌 对金黄色葡萄球 菌的体外生物拮抗作用 从图 2 可以看出， 丁酸 梭菌可以明显抑制金黄色葡萄球菌， 从 12 h 开 始， 其菌落数比金黄色葡萄球菌单独培养时下降 2 , 4 个数量级;鼠李糖乳杆菌对金黄色葡萄球菌 无明显抑制作用; 丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌混合 培养时，从 12 h 开始，金黄色葡萄球菌菌落数下 降 2 , 3 个数量级， 两菌株混合培养对金黄色葡 萄球菌的抑制无协同作用。 时间 /h 金 黄 色 葡 萄 球 菌 数 量 / l g c f u 图 2 丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌对 金黄色葡萄球菌的体外生物拮抗作用 沙 门 氏 菌 数 量 / l g c f u 图 1 丁酸梭菌和鼠李糖乳杆菌对 沙门氏菌的体外生物拮抗作用 时间 /h 0481224364872 7 9 3 5 沙门氏菌 丁酸梭菌+鼠李糖乳杆菌+沙门氏菌 丁酸梭菌+沙门氏菌 鼠李糖乳杆菌+沙门氏菌 0481224364872 7 9 3 5 金黄色葡萄球菌 丁酸梭菌+鼠李糖乳杆菌 +金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 丁酸梭菌+ 鼠李糖乳杆菌+金黄色葡萄球菌 102013 年第 21 期中国饲料 2.3 丁酸梭菌与 鼠李 糖乳杆菌 对产 气荚膜梭菌 的体外生物拮抗作用 从图 3 可以看出， 丁酸梭 菌对产气荚膜梭菌抑制作用明显，从 8 h 开始，可 使菌落数下降 2 , 5 个数量级，在 36 h 时抑菌效 果最明显; 鼠李糖乳杆菌单独作用于产气荚膜梭 菌时，从 12 h 开始，可使其菌落数下降 2 个数量 级以上; 两菌株联合培养对产气荚膜梭菌的抑制 作用在 24 , 48 h 时低于丁酸梭菌单独培养，其 他时间无显著差异。 2.4 丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌对大肠杆菌的体外 生物拮抗作用 从图 4 可以看出，丁酸梭菌能明显 8 h 开始，其菌落数比大肠杆菌 抑制大肠杆菌，从 单独培养时低 3 , 4 个数量级;鼠李糖乳杆菌对大 肠杆菌无明显抑制作用;丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌 混合培养时，可以使大肠杆菌菌落数降低 3 , 4 个 数量级，并且抑菌曲线和丁酸梭菌大体一致，表明 两菌株混合培养对大肠杆菌的抑制无协同作用。 3 讨论 丁酸梭菌是肠道正常微生物， 可以调节肠道 菌群，抑制肠道有害菌。 研究表明，丁酸梭菌可以 对大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌均产生抑制 作用 (曹广添 等 ，2012;Yang 等 ，2012;Cao 等 ， 2012)，降低产气荚膜梭菌在微生物群体中的比例 (Kong 等，2011)。 丁酸梭菌可以产生有机酸降低 肠道 pH 从而抑制有害菌的生长 (张晓阳等， 2012)，同时丁酸梭菌及其脂磷壁酸也可以抑制有 害菌在细胞上的附着(Gao 等，2012)，另外丁酸梭 菌可以减轻艰难梭菌毒素蛋白的毒力并且降低该 菌的数量(Woo 等，2011)。 本试验表明，丁酸梭菌 对产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大 肠杆菌的生长均有明显的抑制作用。 已有研究表 明丁酸梭菌通过产生丁酸、乙酸等短链脂肪酸，产 生细菌素， 以及对营养物质黏附位点的竞争等途 径来抑制有害菌(张晓阳等，2012;Gao 等，2012)。 鼠李糖乳杆菌具有很好的黏附性和抑菌性。 Mack 等(1999)研究表明，鼠李糖乳杆菌可以体外 抑制大肠杆菌，除此之外，鼠李糖乳杆菌对志贺氏 菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、鸡白痢 沙门菌、肠杆菌、肠球菌等有害菌均有一定的抑制 作用(刘冬梅等，2005;魏华等，2001)。 刘冬梅等 (2006)研究表明，鼠李糖乳杆菌可以有效抑制有 害菌，其抑菌原因主要是产生了乳酸，改变了肠道 酸性环境，对有害菌产生抑制作用。 本试验表明， 鼠李糖乳杆菌可显著抑制沙门氏菌和产气荚膜梭 菌， 而对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌无明显抑制 作用，这与之前研究结果略有不同，其原因有待进 一步研究。 随着益生菌制剂在畜牧生产中的大量应用， 单一益生菌应用效果的局限性也慢慢表现出来， 因此几种益生菌的联合发酵和联合使用成为益生 菌制剂发展的新趋势 (冯树和张忠泽，1990)。 Stadie 等 (2013)研究表明 ，乳酸菌与酵母菌混合 培养，酵母菌释放精氨酸有助于乳酸菌生长。双歧 杆菌与嗜酸乳杆菌混合培养时可加快产酸， 双歧 杆菌可促进嗜酸乳杆菌增殖(张香美等，1999)。丁 酸梭菌、肠膜芽孢杆菌、粪肠球菌三种菌的无细胞 上清液彼此之间均有促进生长作用 (薛胜平等， 2008)。丁酸梭菌与双歧杆菌体外共培养可以明显 抑制大肠埃希杆菌 O157、痢疾杆菌 F2a、伤寒杆 菌、艰难梭菌及产气荚膜梭菌的生长(吕存女等， 2011a、b)。 丁酸梭菌和婴儿型双歧杆菌对霍乱孤 菌有拮抗作用， 并且其主要拮抗作用是由丁酸梭 菌引起的(陆俭等，2000)。 本试验结果也表明，丁 酸梭菌和鼠李糖乳杆菌联合培养时对产气荚膜梭 菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均显示 出较强的生物拮抗作用， 其中起主要作用的是丁 酸梭菌。 4 结论 本试验结果表明，丁酸梭菌对产气荚膜梭菌、 产 气 荚 膜 梭 菌 / l g c f u 图3 丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌对 产气荚膜梭菌的体外生物拮抗作用 时间 /h 图 4 丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌对 大肠杆菌的体外生物拮抗作用 0481224364872 8 10 时间 /h 大 肠 杆 菌 数 量 / l g c f u 4 6 大肠杆菌 丁酸梭菌+鼠李糖乳 杆菌+大肠杆菌 丁酸梭菌+大肠杆菌 鼠李糖乳杆菌+大肠杆菌 0481224364872 8 10 4 6 2 产气荚膜梭菌 丁酸梭菌+鼠李糖乳杆菌 +产气荚膜梭菌 丁酸梭菌+产气荚膜梭菌 鼠李糖乳杆菌+产气荚膜梭菌 11中国饲料 2013 年第 21 期 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! (上接第 8 页) [29] Joo S T，Lee J I，Ha Y L，et al.Effects of dietary conjugated linoleic acid on fatty acid composition，lipid oxidation，color，and water-holding capacity of pork loin[J].Anim Sci，2002，80(1):108 , 112. [30] Karin N，Klaus F，Gerd N，et al.Effects of dietary olive and linseed oil on lipid composition，meat quality，sensory characteristics and muscle structure in pigs[J].Meat Science，2005，70:63 , 74. [31] Loughmiller J A，Nelssen J L，Goodb，et al.Influence of dietary total sulfur amino acids and methionine on growth performance and carcass characteristics of finishing gilts[J].J Anim Sci，1998，76(8):2129 , 2134. [32] Mahan D C，Cline T R，Richert B.Effects of dietary level of selenium- enriched yeast and sodium selenite as selenium sources，fed to growing-finish- ing pigs on performance characteristics，and loin quality[J].J Anim Sci，1999，77 (8):2172 , 2179. 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