左旋肉碱

左旋肉碱 附 录 B (规范性附录) 婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定 B.1 范围 本标准规定了婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定方法。 本标准适用于婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定。 本标准检出限为2.0 mg/100g. B.2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 B.3 原理 试样经过水提取，用高氯酸沉淀蛋白质后过滤。滤液经碱皂化后使溶液中复合态的左旋肉碱游离出来。左旋肉碱与乙酰辅酶A在肉碱乙酰转移酶的催化下反应生成乙酰肉碱和游离的辅酶A。游离的辅酶A和2-硝基苯甲酸反应生成黄色物质，其颜色深浅与游离的辅酶A含量成正比。因游离的辅酶A与左旋肉碱是等摩尔反应关系，可间接求出试样中左旋肉碱含量。 B.4 试剂和材料 本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682所规定的三级水。 B.4.1 13%高氯酸溶液:13 mL高氯酸稀释至100 mL。 B.4.2 1.0mol/L氢氧化钠溶液:称取4.0g氢氧化钠用水溶解，冷却至室温后定容至100 mL容量瓶中。 B.4.3 4.0mol/L氢氧化钾溶液:称取22.4g氢氧化钾，用水溶解，冷却至室温后定容至100 mL容量瓶中。 B.4.4 显色储备液:分别称取50mg2-硝基苯甲酸、5.96N-2-羧乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、185mg二水合乙二胺四乙酸二钠(EDTA二钠盐)溶于30 mL去离子水中，用1.0mol/LNaOH(4.2)调pH至7.4,7.6，然后用水稀释至50mL。此液置于4?冰箱中可保存3个月。 B.4.5 显色液:吸取5.0mL显色储备液(C.4.4)用水稀释至25mL。 B.4.6 乙酰辅酶A(Acetyl CoA)溶液(12mol/L):称取20.0mg乙酰辅酶A溶于2.0mL水中(现配)。 B.4.7 肉碱乙酰转移酶(80U/mg:CAT)溶液:100μLCAT悬浮液，用1500rpm离心10min，弃去上层清液，沉淀用2mL水溶解(现用现配)。 B.4.8 左旋肉碱标准溶液 B.4.8.1 左旋肉碱标准储备液:称取8.0mg于干燥器中干燥2h以上的左旋肉碱，溶于水中，并定容至100mL容量瓶中。此液置于4?冰箱可保存1个月。 B.4.8.2 左旋肉碱标准工作液:分别吸取左旋肉碱标准储备液(C.4.8.1)0.5，1，2，3，5mL于25mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。此溶液仅限于当天使用。 B.5 仪器和设备 B.5.1 分析天平:感量0.1mg。 B.5.2 pH计:精度0.01pH。 B.5.3 分光光度计。 B.6 分析步骤 B.6.1 试样处理 称取5g混合均匀的试样(精确至0.1mg)于三角瓶中，用30mL40?温水溶解，冷却后转入100mL容量瓶中。加入10mL13%高氯酸(B.4.1)，混合均匀后静止20min。用蒸馏水定容至刻度，混匀，用定量滤纸过滤。 取滤液20mL，用4mol/LKOH(B.4.3)溶液调pH值为12.5,13.0后，置于40?水浴60min。冷却后用13%高氯酸(B.4.1)将pH调为7.0,7.5。将样液转入50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容。混匀后置于4?冰箱中过夜。将试样处理液从冰箱中取出放置至室温。取上清液用0.45μm滤膜过滤后备用。 B.6.2 标准曲线的绘制 将分光光度计的波长调为412nm。取左旋肉碱标准工作液(B.4.8.2)2.0mL于1cm比色皿中，加入0.8mL显色液(B.4.5)和0.1mL肉碱乙酰转移酶溶液(B.4.7)，混合均匀后放入分光光度计中，反应10min后记录吸光值。以左旋肉碱标准工作液的浓度和吸光值制作标准曲线。 B.6.3 试样测定:取2.0mL试样处理液按B.6.2的步骤测定其吸光值。在标准曲线上查得试样待测液的浓度。 B.7 计算结果和表示 试样中的左旋肉碱的含量X，以质量分数毫克每百克(mg/100g)表示，按式(B.1)计算 c×50 X= m×20×10 ×100 ……………………………………(B.1) 式中: X—样品中左旋肉碱含量，mg/100g; C—由标准曲线上查得的试样处理液浓度，μg/mL; m—试样的质量，g。 在重复性条件下以两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留小数点后一位数字。 B.8 精密度 本部分的精密度数据是按照GB/T 6379的规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。 B.8.1重现性 在重复性条件下获得的两次独立测试结果，在以下给出的平均值范围内，这两个测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，超过重复性限(r)的情况不超过5%，重复性限(r)按以下表中所列数据采用线性内插法求得。 B.8.2再现性 在再现性条件下获得的两次独立测试结果，在以下给出的平均值范围内，这两个测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，超过再现性限(R)的情况不超过5%，再现性限(R)按以下表中所列数据采用线性内插法求得。 左旋肉碱重复性限和再现性限 平均值(g/100g) 18.08 20.42 31.34 重复性限(r) 1.18 2.07 2.18 再现性限 (R) 2.74 3.19 5.01