elisa双抗体夹心法检测幼犬轮状病毒的研究

elisa双抗体夹心法检测幼犬轮状病毒的研究 ELISA双抗体夹心法检测幼犬轮状病毒的研究 核心提示:(西北民族大学动物医学研究所 甘肃 兰州 730030) 摘 要:应用ELISA双抗体夹心法对幼犬轮状病毒感染情况进行调查，结果明兰州地区幼犬轮状病毒感染阳性率为57.1,，其中2,4月龄的幼犬占阳(西北民族大学动物医学研究所 甘肃 兰州 730030) 摘 要:应用ELISA双抗体夹心法对幼犬轮状病毒感染情况进行调查，结果表明兰州地区幼犬轮状病毒感染阳性率为57.1,，其中2,4月龄的幼犬占阳性病例的75.0,，而2月龄以内及大于4月龄的犬感染轮状病毒的病例较少。 关键词:轮状病毒;ELISA双抗体夹心法;幼犬; 兰州地区 犬轮状病毒病是由犬轮状病毒(anine rtavirus, RV) 引起的犬的一种急性胃肠道传染病，多发于幼犬，发病率高，临床上以腹泻为特征。本病多发于秋冬季，尤其是晚冬至早春的寒冷季节。由于尚无有效的犬轮状病毒疫苗，且此类疾病因抗生素、磺胺类等抗生素对其无效，又因不同疾病引起的腹泻在临床表现特征、疾病流行方式上均十分相似，使此类疾病的临床鉴别诊断十分困难。本实验采用ELISA双抗体夹心法，对兰州地区采集的犬腹泻样品进行检测，以此来了解兰州地区犬类轮状病毒的感染情况，从而对本病的诊治提供依据。 1( 材料与 1.1样品: 兰州地区门诊腹泻犬粪样35份，均为临床所见腹泻病犬，病程1d,3d，年龄1日,12月之间，其中母犬13只，公犬22只。 1.2 检测试剂盒:为轮状病毒酶标诊断试剂盒(兰州生物制品研究所生产)，内含48孔包被反应板、酶结合物、阳性对照、阴性对照、酶标洗液、终止液等。 1.3 粪样的稀释:对于过干粪样，用适量生理盐水(约1:10)稀释。 1.4 洗液的配制:取20l酶标洗液(浓缩液)，加入到180l蒸馏水中，按1:10倍稀释。 1.5 器皿的准备:检测过程中所应用到的量筒、烧杯等器皿，均经高压蒸汽灭菌器15磅 20in 灭菌。 1.6 实验程序:按轮状病毒酶标诊断试剂盒使用说明书进行。 1.7 结果判定:使用酶标仪(美国热电THER ,ultiskan K)，以空白孔调零，测定反应后各孔在450n 处的波长读数，即D450值。 检品孔D450值(S)/ 阴性对照D450值(N)?2.1者为阳性;,2.1者为阴性;(若N,0.05，按0.05计算); 实验有效性:阳性对照D450值(P),0.5，则实验成立。 2(结果 2.1 标准对照抗原检测: 本次实验共做标准阳性对照和标准阴性对照各2份次，空白对照1份次，反应后测定D450值，阳性对照D450分别为2.365、2.529，平均值为2.447,0.5，阴性对照D450值分别为0.044、0.043，平均值为0.044;空白对照D450值为0.000，对照系统正常，试验成立。 2.2 样品抗原测定: 共检测腹泻犬类粪样35份，检测出样品阳性为20份，阳性率约为57.1,;对检出阳性样品进行重复实验，结果相同。具体数据结果如下表所示。 项目:国家民委2002年度重点资助项目(2002-ZD-010)，甘肃省2015年度科技支撑课(GK2015-149-101) 作者简介:魏锁成，男，1962年生，甘肃省人，西北民族大学动物医学研究所所长、教授，长期从事动物医学和生物医药的教学和研究工作。 表1:不同年龄段幼犬RV检测结果 2月龄以内 年 龄 2月龄 3月龄 4月龄 4月龄以上 平均阳性率(,) 待检样品数(例) 4 10 9 5 7 35 阳性数(例) 2 6 6 3 3 20 阳性率(,) 50.0 60.0 66.67 60.0 42.86 57.1 表2:各年龄段腹泻犬检测阳性样品D450值 编 号 阳性对照 阴性对照 空白 1 2 3 4 5 D450 值 2.447 0.044 0.000 2.523 2.613 0.133 1.215 0.184 S/N 值 0.000 50.46 52.26 2.66 24.3 3.68 表3:2月龄腹泻犬检测阳性样品D450值 编号 1 2 3 4 5 6 7 D450 值 0.929 1.074 0.408 2.320 0.618 0.273 0.213 S/N 值 18.58 21.48 8.16 46.40 12.36 5.46 4.26 表4:3,4月龄腹泻犬检测阳性样品D450值 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 D450 值 0.298 0.196 1.800 0.333 0.151 0.206 1.942 2.331 S/N 值 5.96 3.92 36.00 6.66 3.02 4.12 38.84 46.62 3(与讨论 3.1 检测结果表明，幼犬的轮状病毒感染在兰州市部分地区已普遍存在，通过对本次采样病犬年龄和检测阳性结果进行统计可以发现，犬轮状病毒感染以2,4月龄幼犬检测的阳性率较高，约为42.9,;而2月龄以内及4月龄以外的幼犬则阳性率较低，约为14.3,。这可能是因为2月龄以内的幼犬体内存在母源抗体的保护而不易感染发病，而大于4月龄的犬则自身可能已对该病毒感染具有一定的抵抗力，因此感染率亦较低。 2,4月龄的幼犬，由于体内母源抗体逐渐减少，而自身的抗轮状病毒抗体尚未产生或产生很少，不足以产生有效的保护力，再加上外界各种因素的影响(如温度、环境卫生状况、饮食等)，使得此阶段幼犬的抵抗力下降，因而临床上的感染发病率高于其他阶段犬类。 3.2 轮状病毒可感染各种幼龄动物，如犊牛、羊、兔、驹等而引起发病，且能交叉感染，只要该病毒在一种动物中存在，就可能造成本病在自然界中长期存并传播，这也是本病普遍存在的重要因素。由于轮状病毒对外界环境具有较强的抵抗力，对温度、pH、多种化学试剂、消毒剂等都有抵抗力，且在成年动物多呈隐性感染并不断排毒，因此一旦畜禽群发生本病，就很可能每年连续发生。 3.3 ELISA双抗体夹心法操作简便，价格相对较低，灵敏度和特异性高，不存在放射污染，且可根据检测目的的不同设计包被抗体和检测抗体。但该法存在一定假阳性的可能性，因此在实际检测过程中应通过阻断实验或重复实验以予排除。本次检测中，对于初次检测呈阳性的样品进行了重复性检测，从而增强了检测结果的可靠性。 3.4 造成犬类腹泻的疾病很多，如严重的犬瘟热、细小病毒感染、冠状病毒感染等，有些较易区别，但有些在临床鉴别诊断过程中则存在一定困难。在本次采样及检测过程中发现，经检测呈阳性的样品大多数为淡黄或鲜黄色稀粪，因此在临床诊断过程中若发现此类腹泻的幼犬，应结合其它症状谨慎下结论。 参考文献: 1. 刘崇海,魏钰书. 轮状病毒感染研究现状. 实用医学临床杂志,2005,2(3):18,20 2. 蔡宝祥. 家畜传染病学.第四版.北京:中国农业出版社, 2001.2 3. 邓小虹,吕立新,陶庆园等. 猪病毒性腹泻病毒实验室诊断. 畜牧与兽医,2004,1(165);49,50 4. 云鹰,马青,石军等. 轮状病毒肠炎病原学三种检测方法对比与临床关系的分析. 临床儿科杂志,2001,19(3):163,164 5. 藤峥,张曦. 轮状病毒快速检测方法的探索. 上海预防医学杂志,2004,16(2):62,63 6. 司徒镇强,吴正军. 细胞培养.第一版.西安:世界图书出版社,2004.3 7. 莽克强, arel Beld, Rui ang. 基础病毒学.第一版.北京:化学工业出版社,2004.3 8. 徐育云,魏祥松,张双庆. 轮状病毒抗原检测试剂的评价及选用策略. 国外医学临床生物化学与检验学分册,2006,26(10):757,760