医学检验技术就业前景 生物医学工程与临床

医学检验技术就业前景 生物医学工程与临床 -62- 生物医学工程与临床2009年1月第13卷第1期BME,ClinMed,January2009,Vol(13,No(1 生物工程?? doi:10.3969/j.issn.1009-7090.2009.01.017 功能化Fe3O4的制备及在 基因转染中的应用 邓迎春，张志培，程庆，王小平，周永安，陆 远，李小飞 摘要:目的探讨修饰了多聚赖氨酸的超顺磁性葡聚糖Fe3O4纳米粒子(简称功能化Fe3O4，DMNP)的制备及其作为基因载体的可行性。方法采用碱沉淀法一步合成了外包葡聚糖的磁性纳米粒子，并用多聚赖氨酸对其表面进行修饰，使之通过静电作用吸附连接DNA。同时应用扫描电镜、红外分光光度计对该纳米复合物的结构及成分进行表征，并 1 用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计对其结合质粒DNA的 能力进行测量，该复合纳米粒子作为基因载体将绿色荧光蛋 白质粒pEGFP-C1转入人肺癌细胞系A549中，并进一步将 载肺癌耐药基因ABCG2-PCDNA3.1质粒转入人肺癌细胞系 A549中。结果该复合纳米粒子分散性好，大小较均一，与 质粒DNA有较好的结合能力，用荧光显微镜观察到了绿色 荧光蛋白的表达，并用PCR技术到了耐药基因ABCG2 的表达。结论该复合纳米粒子能作为一种新型有效的基因载 体在体外将载肺癌耐药基因ABCG2-PCDNA3.1质粒转入人 肺癌细胞系A549中并表达。 关键词:葡聚糖磁性四氧化三铁纳米粒子;多聚赖氨酸; 绿色荧光蛋白;ABCG2-PCDNA3.1质粒;基因载体 文献标识码:A中图分类号:R394文章编号:1009,7090 (2009)01,0062,05 PreparationandapplicationoffunctionalizedDMNPnanoparticlesasgenecarrierDENGYing-chun,ZHANGZhi-(DepartmentofThoracicSurgery,Tangdupei,CHENGQing-shu,WANGXiao-ping,ZHOUYong-an,LUYuan,LIXiao-fei Hospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’ an710038,Shaanxi,China) Correspondingauthor:LIXiao-fei.E-mail:lxfchest@fmmu.ed u.cn 2 Abstract:ObjectiveToexplorethepreparationofsuperparamagneticdextranironoxidenanoparticles(DMNP)modifiedwithpoly-L-lysine,andthefeasibilityofDMNPusedasgenecarrierinvitro.MethodsDextrancoatedmagneticironoxidenanoparticleswerecompositedbydevelopingaconvenientandone-stepdepositionroute.Thenthecompoundnanoparticlesweremodifiedwithpoly-L-lysineonthesurface.Theseparticles(DMNP) combinedwithplasmidDNAbystaticelectricalcharges.Thecharactersofthenanoparticleswereexploredbyseveralmethodsincludingscanningelectronmicroscopy(SEM),fouriertransforminfraredspectroscopy(FTIR)spectra.TheDMNP’ spotentialofcombinationwithplasmidDNAwasalsoanalyzedbyelectrophoresisandUV.TheDMNPboundwithplasmidpEGFP-C1asoneofgenecarrierswastransfectedintohumanlungcancercelllineA549.Theplasmidwhichcar-riedthedrugresistancegeneofABCG2-PCDNA3.1wasalsotransfectedintothesecells.ResultsThesecompoundnanoparticleswereveryuniformanddispersedhomogeneously.ItwasfoundthattheywereverygoodcarriersforplasmidDNA.Theexpressionofgreenfluorescentproteinwereobservedbyinvertedmicroscope.AndtheexpressionsofdrugresistancegeneABCG2werede-tectedsuccessfullybypolymerasechainreaction(PCR).ConclusionThenanoparticleisonekindofn 3 ovelandeffectivegenecarrier.Itcantransfecttheplasmidwhichc arriesthedrugresistancegeneofABCG2-PCDNA3.1intolungca ncercelllineA549invitro.Andthegenehasbeenexpressedinthec ells. Keywords:dextrancoatedmagneticironoxidenanoparticles;poly-L-lysine;greenfluoresceneprotein;plasmidABCG2-PCD-NA3.1;genecarrier 纳米粒子作为一种新型的非病毒基因载体，近年来倍受人们的关注。纳米颗粒是粒径为10-9~10-7m的超微粒子，纳米粒子作为基因载体，在保留了传统基因载体优点的同时，还具有许多传统载体所不具备的优势，当物质小到纳米级 后，会具有表面效应、量子尺寸效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等特点。 作者单位:第四军医大学唐都医院胸外科，陕西西安 710038收稿日期:2008,05,26;修回日期:2008,07,23 作者简介:邓迎春(1983-)，女，湖南张家界人，硕士，实验员，主要从事纳米技术在生物医学中的应用研究。 通讯作者:李小飞。E-mail:lxfchest@fmmu.edu.cn 除此之外，有文献[1]报道当某些无机粒子的粒径小到纳米级时，还可抑制癌细胞的生长与增殖，而对正常细胞影响较小，如TiO2等。这些特点使得纳米颗粒作为基因载体在生物医药和基因治疗等方面有着广阔的应用前景。磁性纳米颗 4 粒作为基因载体，其特殊的纳米效应、超顺磁性、准确的靶向性、极低的毒副性和在外加磁场推动下对细胞膜及血脑屏障强大的穿透性等特点，很大程度上解决了非病毒载体靶向性弱、易被体内的酶降解及杀伤性强等诸多问，使之在肿瘤基因治疗中的应用得到了前所未有的发展[2]。Xiang JJ等[3]采用氧化铁磁性纳米颗粒作为基因载体，从各 生物医学工程与临床2009年1月第13卷第1期BME,ClinMed,January2009,Vol(13,No(1 -63- 方面证实了该纳米颗粒作为基因载体转染的可行性，但未对复合纳米粒子的制备反应机制及粒子的结构形貌做进一步分析，该文将对其展开讨论。同时该文所转染的ABCG2-PCDNA3.1质粒上所携带的耐药基因ABCG2属ABC转运蛋白家族成员之一，可通过主动转运功能将化学药物泵出细胞导致化学药物治疗耐药的发生，该文在分子水平上论证氧化铁磁性纳米复合颗粒能将此基因成功运送至细胞内并表达，这为进一步探讨ABCG2对肺癌A549细胞耐药机制奠定了一定的理论基础。 (poly-L-lysine，PLL)与之混合，用超声波分散1h左右，将反应产物置于铷-铁-硼稀土强磁块上静置3d，磁性分离，用生理盐水重悬，再用滤膜过滤除菌，得到修饰PLL的超顺磁性葡聚糖Fe3O4复合纳米粒子(简称功能化Fe3O4， 5 superparamagneticdextranironoxide nanoparticleswithPLL，DMNP)。1.2.3 DMNP-DNA复合物的制备及检测 将DMNP与质粒DNA按不同的质量比混合，漩涡振荡数秒钟后，于室温下放置10min以上以便充分吸附，得到DMNP-DNA复合物。DNA掺入比计算:测定离心后上清液的体积，用蛋白核酸分析仪测定DNA的浓度，推算游离DNA的含量，计算掺入比例，DNA掺入比=(总DNA量,游离DNA量)/总DNA量× 1 1.1 与方法 仪器和试剂 主要试剂:葡聚糖DT-10、多聚赖氨酸(相对分子 质量30000~70000)、琼脂糖(Sigma产品);氯化铁(FeCl3??6H2O)、氯化亚铁(FeCl24H2O)、氨水等化学试剂均为分析纯;pEGFP-C1、ABCG2-PCDNA3.1均为笔者所在实验室冻存;Trizol、反转录试剂盒、PCR试剂盒(TaKaRa公司);质粒提取试剂盒(U-gene公司);血清铁试剂盒(南京建成公司)。 主要仪器:LEO1530型扫描电子显微镜(SEM)(德国)，Axiovert40倒置显微镜(德国)，BT25S分析天平(德国)， 6 EQUINOX-55红外光谱仪(德国)，Alpha 100%。取最佳浓度，用琼脂糖凝胶电泳进行检测。 1.2.4DMNP介导的绿色荧光蛋白质粒pEGFP-C1 的转染 将5×104个/孔的肺癌A549细胞于转染前1d接种6孔板中，置于37?、体积分数5%CO2的培养箱中培养。培养24h后用无血清的1640培养基洗2次，在无血清的1640培养基下，每孔中转染绿色荧光蛋白表达质粒约2μg，将铷-铁-硼稀土强磁块置于已加入IONP-pEGFP-C1复合物的6孔板下，转染5h后，加入含10%小牛血清的1640培养基，继续培养 2200凝胶成像分析仪(美国)，Forma3111CO2培养箱 (美国)，DU-800蛋白核酸分析仪(美国)，SK5200LH型超声波仪(上海科导超声仪器有限公司)，HERMLE 24~48h，在荧光显微镜下观察结果。1.2.5 DMNP介导的ABCG2-PCDNA3.1质粒的转染 及克隆的筛选 按照上述方法将ABCG2-PCDNA3.1质粒转染肺癌A549细胞，培养48h后，用质量浓度800μg/ml Z360高速低温离心机(德国)，紫外分光光度计Uni-camUV550(美国)，CL-2型恒温磁力搅拌器(河南巩 义予华仪器厂)。 7 G418培养基继续培养，待克隆出现后，改用质量浓度400μg/mlG418培养基继续培养。 1.2.6PCR检测转染细胞mRNA的表达 收集转染后细胞，采用Trizol试剂一步法提取总RNA，逆转录成互补脱氧核糖核酸(cDNA)，以此为模板进行PCR。β-actin引物序列:上游引物为 5′-A-CACTGTGCCCATCTACGAGG′，下游引物为5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′;ABCG2引物序 列:上游引物为5′-AGACTCCAAGGTTGGAACTCA- 1.2实验方法 1.2.1外包葡聚糖的磁性Fe3O4的制备[4] 将质量浓度500mg/L葡聚糖T-10溶解于一定 量的蒸馏水中，待其溶解后，加入质量浓度33mg/L氯化铁(FeCl3?6H2O)、质量浓度12mg/L氯化亚铁(FeCl2?4H2O)，充分溶解后，于60?水浴中逐滴加入一定量的氨水，使pH为12，搅拌下反应1h后，将反应产物置于铷-铁-硼稀土强磁块上，磁性分离，用蒸馏水和无水乙醇反复洗涤，用生理盐水重悬，滤膜过滤除菌，得到外包葡聚糖的磁性Fe3O4(dextraniron oxidemagneticnanoparticles，DMN)。 1.2.2修饰多聚赖氨酸的超顺磁性葡聚糖Fe3O4复 合纳米粒子的制备 8 用血清铁试剂盒，在紫外分光光度计上测出1.2.1节所制备的DMN的浓度，将等质量的多聚赖氨酸 3′，下游引物为5′-GCTTGGAAGGCTCTATGATCT-3′。PCR反应条件:50μl反应体系，95?预变性5min，94?变性40s，62?退火30s，72?延伸50s，72?延伸7min，反应30个循环。 2 2.1 结果 纳米粒子的形成及电镜表现 -64- 生物医学工程与临床2009年1月第13卷第1期BME,ClinMed,January2009,Vol(13,No(1 用碱共沉淀法制备外包葡聚糖的磁性Fe3O4纳米粒子，首先将Fe2+、Fe3+在氨水的作用下水解生成 Fe3O4纳米粒子，在实验中发现氯化铁、氯化亚铁、氨 水及葡聚糖的量、pH、搅拌速度和时间等都会影响 DMNP颗粒的大小。对于分散在水溶液中的Fe3O4纳 米颗粒，其颗粒具有大的比表面积，裸露在颗粒表面的Fe原子与O原子很容易吸附水溶液中的OH-、H+离子，而葡聚糖富含-OH，从而形成了以Fe3O4纳米粒子为核、葡聚糖被吸附包裹在外的复合纳米粒子。 9 PLL上的羧基与葡聚糖上的羟基发生缩水反应，使得葡聚糖外层又包裹上了一层PLL。同时由于PLL带正电，而DNA带负电，两者可以通过静电作用吸附结合。图1、2、3分别为Fe3O4纳米粒子、DMN、DMNP的 扫描电镜图，从图中可以看出所制备的磁性Fe3O4纳米粒子大小均一，容易团聚，而当其外包上葡聚糖后粒子呈方形，分散性明显变好。DMN外包PLL后，颗粒形状稍微发生了一些变化，DMNP颗粒棱角变得模糊。 DMNP的扫描电镜图 Figure3SEMimageofDMNP 图3 米粒子(DMN)在波长为1635.1cm、3405.6cm显示出 Fe3O4官能团的特征伸缩振动，在3420.6cm、2925.1cm、1653.3cm、1423.4cm、1045.4cm、998.8cm处也出 现了葡聚糖T-10官能团的特征伸缩振动峰，说明该纳米复合物同时具备了以上2种成分，由此可证明 Fe3O4纳米粒子的表面已成功地修饰上了葡聚糖T-10。当DMN修饰PLL后，除具备DMN特征吸收峰 外，在1540.8cm、1507.2cm处也显示了C=N特征吸收峰，在3420.6cm处显示出了-OH、-NH特征吸收峰，这表明PLL修饰也是成功的。 Fe3O4纳米粒子的扫描电镜图 10 Figure1SEMimageofFe3O4nanoparticles 图1 图4 红外光波谱图(A:Fe3O4;B:葡聚糖T-10;C:DMN;D:DMNP) Figure4FTIR(A:Fe3O4;B:DextranT-10;C:DMN;D:DMNP) 2.3DMNP与质粒DNA结合率的测定及琼脂糖凝 胶电泳检测 DMNP与质粒DNA以适合的比例混合时显示出了较好的结合率，如图5所示，当混合比例为2?1时 结合率高达88%。当保持质粒DNA量不变，逐渐增 DMN的扫描电镜图 Figure2SEMimageofDMN 图2 加DMNP量时，结合率基本上处于平台期;同样，当保持DMNP量不变，逐渐增加质粒DNA量，当比例从1?2增至1?4时，结合率开始出现大幅度滑坡，后又保持平稳。这是由于DMNP与质粒DNA结合主要靠静电吸附，一定量带正电荷的DMNP只能吸附相 2.2DMN红外光波谱分析 由红外光波谱图(图4)可知，外包葡聚糖的Fe3O4纳 11 生物医学工程与临床2009年1月第13卷第1期BME,ClinMed,January2009,Vol(13,No(1 -65- 当量的带负电荷的质粒DNA，当DMNP或质粒DNA量一定时，吸附达到饱和而出现平台。由此可见， 凝胶电泳结果(图8)显示，转染与未转染A549细胞的cDNA在621bp均出现明亮的条带，该条带为β- DMNP与质粒DNA适合的比例是影响转染效率的主 要原因。琼脂糖凝胶电泳结果(图6)显示，与等质量的游离质粒DNA相比，DMNP-DNA复合物中未见游离的质粒DNA泳出，且点样板口有光亮，这表明 actin扩增产物片段，该现象说明RNA在提取过程中 未被降解。转染了ABCG2-PCDNA3.1质粒的A549细胞中cDNA在480bp处出现了ABCG2的条带，而未转染的A549细胞的cDNA中没有检测到该条带，这说明转染是成功的，该实验结果进一步证实了 DMNP与质粒DNA有很好的结合率。 DMNP作为基因载体的可行性。 1 2 3 2000bp 12 621bp480bp DMNP与质粒DNA在不同质量比时的结合能力 Figure5AbilityofprecipitatingDNAatdifferentW/WratioofD MNPandplasmidDNA 图5 RT-PCR检测ABCG2在肺癌A549细胞中的表达(1.Mark-er2000;2.A549细胞;3.A549细胞转染ABCG2-PCDNA3.1。) Figure8ExpressionofABCG2mRNAinA549cellsasdetectedby RT-PCR(1.Marker2000;2.A549cells;3.A549cellswhichtransfectedABCG2-PCDNA3.1.) 图8 3讨论 基因转移是肿瘤基因治疗的关键技术，一直以来 也是制约基因治疗成功开展的重要问题。传统基因转移系统分为病毒载体和非病毒载体系统。病毒载体转染效率高，但作为病毒载体的病毒制备困难，装载外源性DNA大小有限制，能诱导宿主免疫反应，且具有 DMNP与质粒DNA的结合实验(1.Marker2000;2.质粒 pEGFP-C1;DMNP与pEGFP-C1比例为2?1。) Figure6CombinationexperimentofDMNPandplasmidDNA (1.Marker2000;2.plasmidpEGFP-C1; 13 DMNPprecipitatingpEGFP-C1attheratioof2?1.) 图6 潜在的致瘤性，在安全问题上存在很大隐患[5]。非病毒载体如脂质体，具有操作简单、容易制备、免疫原性低及装载容量大等特点，但采用该类载体转染时，DNA传递和基因表达的效率要比病毒载体系统低很多，其主要原因是由于基因载体在靶位点聚集缓慢及靶位点浓度过低，容易被体内的酶降解[6]，且缺少组织特异性，有一定细胞毒性[7]，这些缺点也限制了非病毒基因载体在基因治疗方面的应用。针对此问题，笔者发展了功能化的Fe3O4(DMNP)基因载体，该载体对细胞毒性较小，不易受到体内各种酶的攻击，并可以逃避巨噬细胞的破坏作用，安全地被靶细胞吞噬，对靶细胞的增殖活性影响较小，可以在磁场作用下实现安全有效的基因靶向释放，解决了基因载体在靶位点浓度 2.4 DMNP介导的绿色荧光蛋白质粒及ABCG2-PCDNA3.1的转染结果分析 DMNP可作为基因载体将pEGFP-C1基因 转入细胞并瞬时表达，在荧光显微镜下可看见发绿色荧光的细胞(如封二插图图7所示)，但转染的效率不是很高，这可能与肺癌A549细胞表面的结构特征及细胞与纳米粒子之间的相互作用有关。转染了 14 ABCG2-PCDNA3.1质粒的肺癌A549cDNA琼脂糖 -66- 生物医学工程与临床2009年1月第13卷第1期BME,ClinMed,January2009,Vol(13,No(1 过低的问题。DMNP中除部分铁被人体利用外，其余的能通过皮肤、胆汁和肾脏等排出体外，且纳米颗粒在体内的循环时间明显长于普通大小的颗粒，在短时间内不会很快被吞噬细胞清除，从而可以延长与细胞的接触时间，提高转染效率，这些优点使之成为目前比较理想的非病毒基因载体。但DMNP进入细胞的方式目前不是很清楚，可能是通过细胞摄粒或胞吞作用。 在笔者研究中，以DMNP为基因载体，将含有耐药基因ABCG2-PCDNA3.1质粒转染至肺癌A549细胞，通过PCR检测到该耐药基因ABCG2的表达，这为进一步研究肺癌细胞的耐药机制提供了新的途径，为开发新药、提高肺癌化学药物治疗疗效有很大帮助，后续工作正在进行中。 将纳米技术和化学药物相结合，在磁导向的作用下靶向性治疗恶性肿瘤是近年来兴起的一种治疗手段。载药的纳米微粒通过磁导向作用聚集在肿瘤部位，不仅提高了肿瘤局部的药物浓度，而且纳米颗粒的可控制性降解使载体内的药物持续性释放，使药物在血液中循环时间延长并维持有效的血药浓度，且致代谢产物减少，易于清除，副作用少[9~11]，这 15 些优点使得纳米药囊获得了普通化学药物无法达到的治疗 效果。该实验中所制备的DMNP，由于PLL上带有氨基， 可通过修饰戊二醛，连接各种带有氨基的抗癌药物如顺铂、 卡铂、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素等来治疗恶性肿瘤，同时还可 连接单克隆或多克隆抗体，在体内实行疫苗的靶向治疗。另 外，Fe3O4本身也可通过硅烷偶联剂进行修饰，硅烷偶联剂 一端与Fe3O4纳米粒子表面的羟基反应，另一端通过化学修 饰也可以直接或间接与生物蛋白分子及化学药物结合，笔者 以前的实验也证实了这点，有关纳米粒子连接化学药物治疗 恶性肿瘤 [12] [8] [1]FengL,LiS,YanY,etal.TheeffectofCaCO3andTiO2nanome-terparticlesonA549andL929cells[J].Bioceramics,2000,13:325-328. 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Differentialad- Differentialadherentcombinedwith Ara-C:5thday,platycyteandfusocellular(×100).Figure4DifferentialadherentcombinedwithAra-C: 10thday,immuno-histochemical 增强型绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞与表面置换珊 瑚人工骨的培养(正文第15~16页插图) A B 图5图5 图6 差速贴壁法联合NGFRp75抗体纯化法组:第5天，细 差速贴 胞以梭形或三极和多极的细胞为主(×200)。图6 壁法联合NGFRp75抗体纯化法组:第10天，免疫组织化 学 CD方法染色(×200)。 19 Figure5DifferentialadherentcombinedwithNGFRp75anti-Differentialadherentcombined bodypurificationmethod:5thday，fusocellular， tripolarormul-tipolorcells(×200).Figure6 withNGFRp75antibodypurificationmethod:10thday,im-muno-histochemicalstain(×200). 图2人骨髓MSC与表面置换珊瑚羟基磷灰石培养(A)4d、 (B)8d、 (C)12d、(D)16d，死活细胞染色的荧光显微镜图(×40)。 功能化Fe3O4的制备及在基因转染中 的应用(正文第65页插图) Figure2TheculturalmorphologyofGFP-labeledhumanboneMSContheSCHA(A)4d,(B)8d,(C)12d,(D) 16d.Thedead-livestainingmicrographsoffluorescencemicroscopy(×40).A B 图7 图3 (A)vonKossa双重染色;(B)骨钙素染色均为阳性。(A) vonKossadoublestaining;(B)BGPstainshowedpositive. 绿色荧光蛋白质粒在肺癌A549细胞中的表达 Figure7TheexpressionofpEGFP-C1inA549cells 20 Figure3 百度搜索“就爱阅读”,专业资料,生活学习,尽在就爱阅读网92to.com,您的在线图书馆 21