降低氧化应激反应调节利托那韦副作用的研究_675

降低氧化应激反应调节利托那韦副作用的研究_675 降低氧化应激反应调节利托那韦副作用的研究 雷伯开 金方 (上海医药工业研究院，创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海 200437) HIV蛋白酶抑制剂(PI)利托那韦(RTV)能够明显抑制HIV病毒的复制，延长患者生存。但给予RTV治疗的患者出现了众多的毒副反应，最主要的是血脂代谢异常。在HIV感染患者中，心血管疾病是引起死亡的4大因素之一。其副作用机制的研究受到了广泛关注，发现RTV能够引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress)、诱导炎症因子(肿瘤坏死因子TNF-α、白介素-6等)释放、氧化应激(oxidative stress)、诱导脂质合成蛋白表达升高等，这些相关机制均与血脂代谢异常密切相关，但降低副作用的研究仅见个别报道。研究发现，氧化应激间接或直接的参与了药物所致副作用，可以推测，降低氧化应激反应能够改善副作用。采用抗氧剂来降低氧化应激，进而改善血脂异常等具有切实可行性。 自微乳给药系统能够显著提高药物溶解度，且制备工艺简单，在胃肠道消化液及肠道蠕动下即可自发形成微乳，个体差异性小，成为较理想的RTV新型给药系统。 1 仪器和药品 Agilent 液相色谱仪(美国安捷伦公司);CO细胞培养箱(美国赛默飞2 公司);生物安全柜(美国Nuaire公司);Wallac 1420 多功能全波长读板仪 (美国PerkinElmer 公司);Bio-Rad凝胶电泳仪(美国Bio-rad);倒置显微镜(日本olympus);离心机 (德国eppendorf公司)。 维生素C和E、亚油酸乙酯、油酸、DCFH-DA(2,7-dichlorofluorescein diacetate)均购自sigma-aldrich;抗C/EBP-homologous protein (CHOP)抗体，抗Lamin B,抗体，均购自Santa Cruz公司;Bio-Rad蛋白测定试剂盒购自Bio-Rad公司，cremophor EL(德国basf公司);DMEM培养液(美国invitrogen公司)。 2 实验与 2.1 ROS测定 用DCFH-DA测定细胞内ROS，其原理为DCFH-DA 扩散通过细胞膜，被细胞内的酶水解成为DCFH，在ROS 存在的情况下被氧化成有荧光特性的DCF，极性大，不能透细胞膜而留在细胞内，测定细胞内的荧光强度反映ROS水平。测定的激发波长为485 nm，发射波长为520 nm。 巨噬细胞培养于12孔板，至80%饱和度时给药，孵育4h后，移除培养液，用PBS冲洗细胞2次，每个孔加入1ml用不含血清的DMEM配成的10μM DCFH-DA，培养箱中孵育30min后，用冷PBS缓冲液冲洗2次，收集细胞，一部份用于蛋白浓度测定，一部份用裂解液(0.1M NaOH，50%甲醇配制)裂解，细胞裂解液经5000r/m离心5min，取上清液200μl到96孔板，于荧光分析仪测定荧光强度，并用所测得的细胞蛋白浓度进行矫正。 2.2 内质网应激-CHOP蛋白测定 HIV PI能诱导细胞内质网应激，刺激凋亡蛋白CHOP合成。将细胞培养于60mm培养皿，待细胞长至80%饱和度后，给予不同药物处理4h后，收集细胞，提取细胞核蛋白，制备蛋白样品用于凝胶电泳分离CHOP及内参Lamin B蛋白，western blot法进行蛋白定量。 2.3 ELISA测定炎症因子 巨噬细胞于24孔培养板，给药24h后，收集细胞培养液，ELISA法测定其中炎症因子浓度，并收集细胞测定蛋白浓度，将炎症因子对蛋白浓度进行矫正。 2.4 RTV溶解度 取5ml PBS(pH 7.4)、0.1M HCL于10ml具塞试管，另取1ml不同的油于10ml具塞试管，加入过量RTV，置于室温25ºC、37ºC恒温水浴振荡24h后，3000r/m离心5min去除不溶药物，取上清液用0.45µm滤膜过滤后，续滤液适量用乙腈稀释后，HPLC测定浓度。 2.5 油水分配系数测定 将1mg RTV分散在不同的油相中，摇瓶法振摇12h后，分离油相和水相，HPLC测定浓度，计算油水分配系数。 2.6 RTV自微乳制备与粒径测定 分别取处方量的辅料和RTV制备空白自微乳和含药自微乳，扫描电镜法观察RTV SMEDDS与空白SMEDDS形成的微乳液。 2.7 RTV自微乳体外细胞吸收 肠上皮细胞IEC-6培养于6孔细胞培养板，分别给予15µM不同的RTV:RTV DMSO溶液、RTV微乳溶液、RTV Norvir乳液，于给药后0.25、0.5、1、2、4、8和24h用去离子水收集细胞，取细胞悬液80µl于1.5ml离心管中，加入120µl乙腈沉淀蛋白，离心10min(13200r/m)2次，取上清液25µl进样HPLC测定;余下部分细胞悬液用于测定蛋白浓度，将细胞内药物量用蛋白浓度进行矫正。 2.8 RTV自微乳体外细胞副作用考察 分别考察RTV自微乳对细胞的ROS、CHOP和炎症因子表达的影响，操作同前2.1,2.3。 2.9 RTV自微乳体内给药 SD大鼠6只，体重200,250g，禁食不禁水12h后，口服灌胃给药，剂取雄性 量50mg/kg，间隔1周后交叉给药，给药组为: RTV自微乳、RTV Norvir，于给药后0.5、1、2、3、4、6、12、24h时，自大鼠尾静脉取血0.3ml于离心管，5000r/m离心5min，提取药物，HPLC法测定血药浓度。 -/-取野生型小鼠(wild type mice，Wt)和CHOP基因敲除小鼠(CHOP)各 24只，随机分为4组，每组6只，口服灌胃给药，分为空白对照、RTV Norvir (50mg/kg)、RTV SMEDDS (50mg/kg)、空白微乳，连续4周。最后1次给药后口服灌胃400mg/kg的异硫氰酸荧光素钠标记右旋糖苷(FITC-dextran，4KD)，4h后处死动物，取血及分离血浆，取20µl血浆，加入适量PBS稀释，置于96-孔板，测定荧光强度，以空白血OD值为对照，计算各血样中FITC-dextran相对浓度;部分血样用Wako脂类检测试剂盒测定胆固醇、甘油三酯水平。 3 结果与讨论 3.1 抗氧剂降低RTV诱导的ROS、CHOP及炎症因子表达 如图1所示，与对照组相比，RTV增加ROS生成约1.6倍，不同种类的抗氧剂均可不同程度的减少RTV导致的ROS生成，依序为亚油酸乙酯、VC、VE、油酸;而内质网应激阳性物质TG在25nM即可显著增加ROS达3.2倍，与HO22对照组相近。这表明内质网应激与ROS之间存在紧密联系，内质网应激可增加ROS生成。 图1 抗氧剂降低RTV诱导ROS表达的作用 内质网应激过程中的众多转录因子包括ATF-4、XBP-1以及CHOP，其中CHOP与细胞凋亡紧密相关，因此，通过测定CHOP蛋白表达可用来RTV诱导内质网应激的程度。图2结果表明，RTV显著增加了CHOP蛋白的表达，增幅高达近50倍，VC能够降低RTV诱导的CHOP表达近50%，VE效果却不显著，仅降低15%，亚油酸乙酯20、40μg/ml分别降低RTV诱导CHOP达40%和90%，油酸降幅约为35%，TG引起CHOP表达升高达到对照组的80倍。 图2 抗氧剂对RTV诱导CHOP表达的作用 细胞炎症因子释放与RTV的副作用相关，巨噬细胞为炎症因子产生的主要细胞。将细胞与RTV培养24h后，RTV显著增加TNF-α、IL-6的释放，与对照 组相比，升高程度分别为2.7、4.5倍;抗氧剂均可明显抑制RTV引起的炎症因子释放，结果如图3。 图3 抗氧剂对RTV诱导炎症因子释放的作用 3.2 RTV理化性质考察及其自微乳的研制 RTV在水相中与不同的油相及油相组合中的溶解度结果见表1，油水分配系数结果见表2，可以看出，RTV水溶性差，亲脂性较强，在油相中溶解度显著高于水中，油酸能够显著增溶药物，并提高药物的油水分配系数。 表1 RTV在不同溶剂中的溶解度 RTV solubility (mg/ml) Solvents 25ºC 37ºC 0.1 M HCl 0.00325?0.00017 0.00549?0.00019 PBS 0.00145?0.00012 0.00276?0.00018 Ethyl linoleate 5.25?0.22 5.55?0.23 Cremophor EL 67.3?1.02 97.3?1.55 Ethyl linoleate+Cremophor EL(1:1) 64.3?1.36 79.3?1.8 Ethyl linoleate+Oleic Acid(3:1) 136.7?2.02 142.7?2.5 Alcohol >150 >150 Oleic Acid 138.7?1.88 >150 表2 RTV在不同体系中的油水分配系数 partition coefficient Ratio of oil/aqueous phase lgP n-octanol/PBS 1687.8?15.8 3.23?0.03 n-octanol /0.1M HCl 248.6?9.2 2.4?0.02 Ethyl linoleate/PBS 158.4?6.4 2.2?0.01 Ethyl linoleate -oleic acid(3:1)/PBS 2617.2?32.2 3.42?0.05 所制备得到的自微乳粒径在100nm以下，如图4，而RTV的加入使微乳粒径增大，主要由于RTV溶解在油相中，增加了油相比例而使得微乳的粒径增大。 图4 RTV SMEDDS扫描电镜图 3.3 RTV自微乳体外细胞实验 RTV在IEC-6细胞模型的吸收结果如图5，药物吸收速度快慢依次为:RTV DMSO>RTVME>RTV Norvir，达峰时间分别为30min、1h、2h，吸收速度与药物在培养液中存在的形式或粒子大小有关。 图5 RTV在IEC-6细胞中的吸收(n=3) RTV自微乳体外的细胞副作用研究结果如图6，可见采用抗氧剂为主要辅料所得RTV自微乳引起的副作用要低于RTV DMSO溶液和上市制剂Norvir。ROS、内质网应激、炎症因子三者相互影响，相互作用，降低ROS可有效的改善内质网应激和炎症反应，验证了本研究的推测。 图6 RTV自微乳对细胞ROS(左)、炎症因子(中)及CHOP(右)表达的影响 3.4 RTV 自微乳体内给药 大鼠口服给药后的药-时曲线如图7，RTV 自微乳的AUC、T1/2、Tmax -1-1与Cmax分别为49.2?2.4µg?h?ml、3.57?0.41h、1h、7.13?0.56µg/ml，而Norvir -1-1的分别为52.1?6.8µg?h?ml、3.49?0.51h、3.33?0.57h、6.03?1.52µg/ml。另外，数据统计发现，自微乳给药动物各个时间点的血药浓度差异较小，个体差异性低于Norvir。 图7 RTV口服给药药-时曲线 FITC-dextran作为大分子荧光标记物，水溶性良好，在pH4,10的溶液中稳定，而且体内生物相容性良好，主要以渗透的形式通过肠道上皮组织，通过测定其血中荧光强度，可以用来反映肠道的损伤，结果如图8，RTV长期给药会导致 -/-肠道上皮通透性增加，血中FITC-dextran显著增加。而比较野生型小鼠与CHOP -/-基因敲除小鼠血中FITC浓度，可以发现，CHOP基因敲除后，RTV导致的通透性升高要比野生型小鼠的程度低，表明CHOP蛋白或基因参与了RTV导致的通透性增加的调控过程。空白微乳连续给药对肠道上皮的通透性未见影响。 图8 RTV给药对肠道损伤作用-FITC荧光测定 小鼠连续给药4周后的血脂水平:甘油三酯、游离胆固醇、总胆固醇水平测 -/-定结果如图9，RTV口服给药使得野生型与CHOP基因敲除小鼠血脂水平均明显 -/-升高，而无论是野生型还是CHOP基因敲除小鼠，RTV 自微乳给药组的血脂升 高程度较RTV Norvir组低，而空白微乳组与对照组相比未见明显区别。 图9 小鼠4周给药血脂测定 4 结论 为探讨抗氧剂在改善HIV PIs副作用上的应用，我们通过体外细胞实验，筛选多种抗氧剂，考察其减轻RTV引起的ROS，发现抗氧剂不仅能够降低ROS，还同样能够降低内质网应激、细胞炎症因子的表达。在此基础上制备的RTV自微乳，副作用也明显改善，在小鼠口服给药后， RTV自微乳降低了药物对肠道的损伤，引起的胆固醇和甘油三酯水平升高明显低于上市制剂。实验结果说明，采用抗氧剂制备RTV的口服自微乳能够有效减轻药物副作用。这也是首次联合运用分子生物学和制剂学手段来改善RTV副作用的尝试，为如何改善RTV等蛋白酶抑制剂的血脂代谢异常等副作用研究提供新的思路。 参考文献略