皮肤角质化细胞及KiPS在临床中的应用

皮肤角质化细胞及KiPS在临床中的应用 2010年12月 第24卷第4期总82期 :京联合大学(自然科学版) JournalofBeijingUnionUniversity(NaturalSciences) Dec.201O Vo1.24No.4SumNo.82 皮肤角质化细胞及KiPS在临床中的应用 胡斯乐一,吴江鸿,闫祖威,张文广,张家新 (1.内蒙古自治区动物遗传育种与繁殖重点实验室,呼和浩特010018; 2.内蒙古农业大学动物科学学院,呼和浩特010018;3.内蒙古农业大学理学院,呼和 浩特010018) [摘要]角质化细胞是最常见的皮肤细胞类型,其通过分泌角蛋白而形成皮肤面 的角质层, 从而防止机械损伤,紫外辐射及水分流失,在治疗皮肤烧伤方面角质化细胞倍受青 睐.另外,由 于其遗传操作较易,后期治疗效果理想,表皮角质化细胞被广泛用于皮肤非遗传疾 病的基因治疗 载体.由于近两年来角质化细胞来源的诱导多潜能干细胞的成功,使得角质化细胞 在医学领域 备受关注. [关键词]角质化细胞;基因治疗;临床应用 [中图分类号]R458[文献标志码]A[文章编号]1005-0310(2010)040064-05 EpidermisKeratinocytes,KiPSandClinicalApplication Husile,WUJianghong,YANZu—wei,ZHANGWen—guang,ZHANGJia.xin'. (1.KeyLaboratoryofAnimalGenetics,BreedingandReproduction,Hohhot010018,China; 2.CollegeofAnimalScience,InnerMongoliaAgriculturalUniversty,Hohhot010018,Chin a; 3.CollegeofScience,InnerMongoliaAgricuhuralUniversity,Hohhot010018,China) Abstract:Keratinocytesarethemostcommoncellsinskin.Itsprimaryfunctionistheformationofthekeratin layerthatprotectstheskinandtheunderlyingtissuefrommechanicaldamage.UVradiationandwaterloss.Kera— tinocyteswinresearchers'favourastargetcellsforlargeburntherapy.Keratinocytesarepartic ularlysuitedtoge— neticmanipulationandfollow-upoftherapeuticeffectsforskindefectsandsystemicabnormalitiesbycutaneous genetherapy.Thesuccessofkeratinocyte— derivediPS(KiPS)celltechnologybringskeratinocytestothemedical domain. Keywords:keratinocyte;genetherapy;clinicalapplication O引言 在过去20年里,越来越多的研究者及医生把 细胞治疗作为治愈皮肤创伤和非遗传性疾病 的新方法.由于表皮细胞可作为许多细胞生物学 研究的材料,还包括为重度烧伤病人的创伤修复提 供移植而开发的复杂三维组织模型,其价值不言而 喻…. 许多研究组都认为角质化细胞非常适合作为 皮肤和基因治疗的目标细胞,因为角质化细胞 具有较易获得,移植后的转基因角质化细胞的表达 情况易监测,角质化细胞可作为生物反应器释放转 基因蛋白因子来缓解由于某种蛋白缺陷而引起的 皮肤疾病等优点.研究者将4种因子(OCT4, SOX2,KLF4andc—MYC)转入角质化细胞中,成功 [收稿日期]2010—07—05 [作者简介]胡斯乐(1985一),女,内蒙古乌兰浩特人,内蒙古农业大学动物科学学院 在读硕士,主要从事细胞生物学 研究. [通讯作者]吴江鸿(1982一),男,内蒙古土左旗人,内蒙古农业大学动物科学学院在 读博士,主要从事动物遗传育种 和分子生物学研究. 第24卷第4期胡斯乐等:皮肤角质化细胞及KiPS在临床中的应用65 诱导形成了多潜能干细胞,更拓宽了角质化细胞在 医学方面的应用. 1角质化细胞 皮肤作为哺乳动物最大的器官,是机体与外界 的机械屏障,具有复杂的组织结构和多重生理功 能.皮肤分为表皮和真皮两层,表皮位于真皮的 上面,较薄而不含血管,主要由分层的表皮角质化 细胞组成,它们可以分泌角蛋白和角蛋白关联蛋 白,这两种蛋白可以为皮肤,头发和指甲提供强度. 角质细胞由皮肤深层的基底细胞层形成,具有持 续,快速的增殖能力,是由一部分多潜能干细胞持 续再生而来,并逐渐向上迁移,经过一个多月的分 化过程最终形成皮肤表面的鳞状细胞.正常条件 下,各层角质化细胞都通过桥粒相连,并通过半桥 粒锚定在一种特异的细胞外基质——基底膜上,根 据其不同的分化过程及细胞形态通常分为4层:基 底细胞层,棘细胞层,颗粒细胞层和角质层,如图 1所示. 在角质化细胞脱离基底层向上迁移的过程中, 经终末分化后形成了皮肤表面的屏障最终脱落. 成纤维细胞位于表皮下面,被基底层隔开的真皮 中,为角质化细胞提供生长因子.角质化细胞的体 外培养已经证实这种模式很重要,这就使得从同一 样品分离角质化细胞和成纤维细胞成为可能.还 有几种其他细胞也可以从皮肤中分离得到,如上皮 细胞和表皮黑素细胞.角质化细胞也可从拔出的 毛发中获得.毛囊是复杂的表皮附属物,它可深达 真皮,持续经历快速生长期,退行期和休止期.毛 囊外层的外根鞘细胞本质上是作为分层的表皮角 质化细胞而存在,与表皮相邻,因此,角质化细胞很 表皮 真皮 脂肪组织 容易从毛囊外根鞘中分离获得. 2角质化细胞的培养 为了在体外获得表皮角质化细胞,研究者开发 应用了几种体外培养系统.然而,这些体系大部分 都应用了血清培养,而血清含有复杂的蛋白混合 物,营养成分等许多不确定的成分,其中也包括生 长促进和抑制因子.所以这就影响了用这些体系 研究各种细胞因子和生长因子对细胞作用的推广. 已经报道的多种培养人类表皮角质化细胞的 方法,都存在不足,问主要有两个方面: 1)由于相对简单的培养系统都会造成在细胞 传代过程中,一些表皮特性的丧失. 2)为了模拟体内的表皮生长环境,在体外原 代培养重构真正的表皮,做了很多巧妙的尝试.而 这些培养系统的选择依赖于研究者要解决的课题. 1975年,Rheinwald等采用3T3成纤维细胞作 为滋养层,体外培养人表皮细胞获得成功E93;1981 年0'Conner首次应用此方法在体外培养出适于移 植的自体表皮细胞膜片,经长时间临床观察,发现 表皮细胞膜片脆性大,移植成功率低,而且抗感染 能力差,移植后表皮不耐磨擦,容易出现水疱,培养 表皮自体移植物由于缺少真皮成分致使移植后表 皮易结痂收缩,与创面结合不稳固?.人们意识 到需在膜片下增加支持物,可以解决临床上一定厚 度,柔韧性和可操作性的要求.Horch等将角质细 胞悬浮在纤维蛋白胶中培养,用于慢性皮肤创伤的 治疗,发现这种方法能够缩短表皮细胞层的体外培 养时问,且操作简便,费用低廉.无血清培养基 的出现改变了传统的组织培养模式,使得角质化细 胞在没有真皮细胞存在的条件下成功培养成为可 图1皮肤结构模式图 (左边是整个皮肤的模式图,右边为表皮的不同层及相应的标记蛋白) 66北京联合大学(自然科学版)2010年12月 能",且其化学成分是确定的.其中一些含低钙 离子的已知成分培养基可以提高未分化的小的多 边形细胞的单层培养率,使得体外获得大量的角质 化细胞成为可能.E1一GhalbzouriA采用一步法将已 培养融合的表皮细胞膜片贴附于可降解的已长满 成纤维细胞的聚合物PEGT/PBT上,获得成功. 3KiPS的成功 2006,2007年,日本和美国研究小组先后用4 种基因(Oct4,Sox2,Klf4andcMyc)将小鼠(2006 年8月)和人(2007年11,12月)的体细胞在体外 重编程为诱导性多潜能干细胞(inducedpluripotent stemcells,iPScells)?",此后在短短两年多时间 内,对iPS细胞的研究和关注度呈爆炸式增长.体 细胞重编程,去分化和多潜能干细胞来源等一系列 热点问题再次成为干细胞和发育生物学等研究的 热点和焦点. iPS细胞是将特定的转录因子进行强表达而改 变了其本身的细胞特性,其与胚胎干细胞相类似, 具有无限的自我更新和诱导分化为任何细胞类型 的潜能.因此,iPS的成功不仅对细胞潜能分子机 理的研究领域进行了革新,也使得为患者进行细胞 替代疗法时,寻找特异细胞更加容易.此外,由于 伦理和排斥等问题存在而让经典的胚胎干细胞治 疗技术举步维艰,这就给iPS临床治疗的发展提供 了无限的空间.然而由于获得iPS的过程繁琐,效 率低下等难题,使得人们不得不重新审视iPS替代 ES的可能性,iPS又面临着巨大的挑战. 细胞的来源,类型,年龄等因素都会影响获得 iPS的过程,因此,哪类细胞重新编程和再分化后最 实用于iPS过程还不是很清楚.角质化细胞不同 于成纤维细胞是表皮细胞,极容易获得且包含有干 细胞,2008年,Aasen等人将4种基因转入人角质 化细胞而获得KiPS.与人成纤维细胞重编程相比, 人角质化细胞的重编程更加高效(100倍),所需时 间更短(0.5倍).进一步研究表明,成人单个毛发 来源的KiPS的获得效率同样很高.所得KiPS无 论是在体外还是在体内都能分化成内,外,中3胚 层的所有细胞类型.这就为KiPS的获得和分化 提供了实验基础和理论依据. 4角质化细胞及KiPS在医学中的应 用 角质化细胞是最常见的皮肤细胞类型,其通过 分泌角蛋白而形成皮肤表面的角质层,从而防止机 械损伤,紫外辐射及水分流失.在治疗皮肤烧伤方 面角质化细胞倍受青睐.另外,由于其遗传操作较 易,后期治疗效果理想,表皮角质化细胞被广泛用 于皮肤非遗传疾病的基因治疗载体.另由于近两 年来角质化细胞来源的KiPS的成功,使得角质化 细胞在医学领域备受关注. 4.1角质化细胞在皮肤移植中的应用及KiPS的 应用前景 20多年来,治疗皮肤大面积烧伤技术不断进行 改进,通过自体的角质化干细胞的体外扩增后置换 表皮.然而该技术的主要缺陷是获得大量细胞的 时间较长(3周),增加了病人脱水及感染的风险. 另一种方法就是用牛胶原,异源成纤维细胞或角质 化细胞做出的半合成皮肤替代物,可以形成基底膜 让表皮与真皮问重建连接.然而,这种半合成替代 品不能很好地保护受伤的皮肤,同时由于包含成体 供体细胞而引起严重的免疫排斥反应. 人类胚胎干细胞因其在体外可以无限增殖,移 植后免疫原性低,并可分化为任何类型的细胞.目 前包含干细胞的皮肤替代物不仅可以快速防止体 液的流失和伤口感染,而且可以达到满意的治疗效 果.要想对烧伤的治疗达到理想效果,就得有序地 整合在细胞迁移和增殖过程中一系列的生物学和 分子事件,完成细胞外基质沉积与重塑.而干细胞 可以提高修复的质量,降低疤痕的形成并重建具有 正常功能的皮肤及其附属物.Liu等人2008年证 明包含间质干细胞(MSC)的组织工程皮肤可加速 创伤修复,达到令人满意的效果?.2009年Gue— nou等人用人类胚胎干细胞(hESCs)分化获得基底 角质化细胞,并成功形成类似正常人的复层表 皮.. 人类胚胎干细胞分化为角质化细胞的技术已 经成熟,但由于人类胚胎干细胞受伦理及其他因素 影响获取不易,所以只能从自体的皮肤组织中获得 皮肤干细胞,但由于皮肤干细胞是从表皮细胞中分 离获取,其增殖潜能较低?.KiPS另辟蹊径,因其 在体外可以无限增殖,并可分化为任何类型的细 胞.Tokumoto等人2010年的研究表明,iPS细胞的 抗分化能力较胚胎干细胞更强.多个研究小组 的分析都表明iPS在传代培养后核型正常,其转录 特性和表观遗传特性与胚胎干细胞相类似.虽然 目前还没有用KiPS治疗烧伤的病例,还存在一些 限制因素,但由于KiPS容易获取,免疫原性低, 第24卷第4期胡斯乐等:皮肤角质化细胞及KiPS在临床中的应用67 增殖能力强,产生的组织工程皮肤的免疫排斥弱等 特点,在皮肤移植中必将大行其道. 4.2角质化细胞及KiPS在基因治疗中的应用 由于皮肤是最大且最易获得的器官,因此治疗 性基因转移中被用作目标细胞.皮肤由具有自我 更新能力的表皮,真皮和皮下脂肪层构成.表皮包 含大量的角质化细胞,黑素细胞和朗格汉斯细胞, 不含血管,因此,表皮合成的蛋白与基底膜交联,把 表皮层锚定在真皮上,更重要的是获得血液供应. 角质干细胞来源于表皮基底膜和毛囊轮突部,每层 特异的启动子调控了短暂倍增细胞的出现.基底 层的K5和K14,颗粒层的K1和K10和最上层的外 皮蛋白与转谷氨酰胺酶(如图1).角质层形成致 密的表皮屏障保护皮肤免受来自外界环境的影响, 这就使得皮肤的基因治疗从理论变成现实.表皮 的更新周期是28天,限制了外源基因的长期表达, 因此短暂倍增细胞是优先选择转染的对象. 最近已证实经遗传修饰的人角质化细胞可以成 功治疗皮肤紊乱,纠正皮肤蛋白缺陷,另外还可以分 泌外源蛋白调整系统活动.角质化细胞与其他细胞 相比更易作为基因治疗的靶细胞.原因如下: 1)由于角质化细胞中存在干细胞,所以可以 维持外源基因在皮肤中的长期表达. 2)因为表皮角质化细胞是分层的,而不同层 都有角质化细胞的特异标记基因,这就使得精确调 节外源基因的表达效率与位置成为可能. 3)作为皮肤表面的组织,角质化细胞更易培 养移植,为体外治疗和体内治疗提供材料. 4)基因治疗后,如果有突发事件发生,就可以 通过取样来检测其变化情况. 5)角质化细胞具有的分泌能力可以为局部或 系统提供外源蛋白. KiPS的出现更加拓展了角质化细胞基因治疗 的领域,不止是通过皮肤系统来纠正蛋白的缺项, 同时可以治疗其他类型的基因缺陷.例如,通过 iPS细胞对小鼠的镰刀状细胞贫血症的治疗,Jae. nisch研究小组先取人类镰刀状细胞贫血病模型小 鼠尾部的皮肤成纤维细胞,利用逆转录病毒导人 Oct4,Sox2和Klf4基因,慢病毒导入c—Myc基因,建 立了小鼠自身的iPS细胞系.接着,研究人员通过 同源重组技术纠正人类链状血红蛋白等位基因,并 将由iPS细胞诱导分化的造血干细胞输注给模型 小鼠,小鼠的贫血症状得到明显改善.随后, Wernig等人报道小鼠成纤维细胞产生的iPS细胞 在体外能够有效分化为多种神经细胞.研究人员 将iPS细胞注射到胚胎小鼠的脑室内,9周后iPS 细胞存在于小鼠脑的各个区域,并且分化成神经胶 质细胞和神经元细胞.分化的神经元细胞具有神 经元和突触的形态,表达特异的细胞标志基因,参 与小鼠电生理活动.研究人员进一步研究发现,当 iPS细胞分化形成的多巴胺能神经元细胞被移植进 入帕金森模型小鼠大脑运动功能受损的一侧后,小 鼠运动功能得到显着改善.因为KiPS细胞较 来自成纤维细胞的iPS(FiPS)细胞更易获得,所 以KiPS细胞在基因治疗方面的应用范围较FiPS将 会更广. 5展望 角质化细胞因其永久存在于皮肤内,提供皮肤 终生的自我更新能力,因此是皮肤疾病基因治疗的 合适靶细胞,受到人们的关注.该技术的核心就是 将外源基因转入角质化细胞,通过其自身对外源基 因表达的调控来实现.角质化细胞体外扩增后,可 作为组织工程复合皮肤中表皮的种子细胞,能使移 植的表皮在创面上长期存在,达到永久覆盖的目 的,这对大面积的创面尤其重要.KiPS细胞给角质 化细胞的临床应用提出了全新的研究思路.角质 化细胞与KiPS细胞间的相互转化为其遗传操作提 供了极大的便利,大大加速了角质化细胞及KiPS 细胞在医学领域的应用.我们完全有理由相信, 角质化细胞及KiPS细胞在未来的再生医学与基因 治疗中将大放异彩. [参考文献] [1]GuenouH.Humanembryonicstem— cellderivativesforfullreconstructionofthepluristratifiedepidermis:apreclinicalstudy [J].Lancet,2009,374(9703):1745—1753. [2]HenggeUR.Genetherapyprogressandprospects:theskin— easilyaccessible,butstillfaraway[J].Genetherapy,2006,13 (22):1555—1563. [3]AasenT.Efficientandrapidgenerationofinducedpluripotentstemcellsfromhumankeratinocytes[J].NatBiotech,2008,26 (11):1276—1284. [4】DelRioM.Currentapproachesandperspectivesinhumankeratinoeyte— basedgenetherapies[J].Genetherapy,2004,11 68北京联合大学(自然科学版)2010年12月 [5] [6] [7] [8] [9] (Suppl1):$57一$63. AasenT,BelmonteJC.Isolationandcultivationofhumankeratinocytesfromskinorpluckedhairforthegenerationofinduced pluripotentstemcells[J].NatProtoc,2010,5(2):371—382. Maas— SzabowskiN,StarkHJ,FusenigNE.Cellinteractionandepithelialdifferentiation[M].NewYork:S.2002:31—63. BohnertA.Epithelial— mesenchymalinteractionscontrolbasementmembraneproductionanddifferentiationincuhuredand transplantedmousekeratinocytes[J].CellTissueRes,1986244(2):413—429. BarlowY,PyeRJ.Keratinocyteculture[J].MethodsMolBiol,1997(75):117—129. RheinwaldJG,GreenH.Formationofakeratinizingepitheliuminculturebyaclonedcelllined erivedfromateratoma[J]. Cell,1975,6(3):317—330.. [10]0ConnorNE.Graftingofburnswithculturedepitheliumpreparedfromautologousepidermalcells[J].TheLancet,1981 317(8211):75—78. HorchRE.CulturedhumankeratinocytesontypeIcollagenmembranestoreconstitutetheepidermis[J].Tissueengineer— ing,2000,6(1):53—67. BoyceST,HamRG.Calcium— regulateddifferentiationofnormalhumanepidermalkeratinoeytesinchemicallydefinedclonal cultureandserum-freeserialculture[J].JournalofInvestigativeDermatology1983(81):33s一40s. RikimaruK.Growthofthemalignantandnonmalignanthumansquamouscellsinaprotein— freedefinedmedium[C]//Vitro Plant,1990,26(9):849—856. Cellular&DevelopmentalBiology— TsaoMC,WalthallBJ,HamRG.Clonalgrowthofnormalepidermalkeratinocytesinadefinedmedium[J].CellPhysiol, 1982,110(2):219—229. ElGhalbzouriATheuseofPEGT/PBTasadermalscaffoldfoxskintissueengineering[J].Biomaterials,2004,25(15): 2987—2996. OkitaKT,IchisakaYS.Generationofgermline?competentinducedpluripotentstemcells[J].Nature,2007,448(7151): 313—317. YuJ.Inducedplmipotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells[J].Science,2007,318(5858):1917—1920. LiuP,Dengz,HanS,eta1.Tissue— engineeredskincontainingmesenchymalstemcellsimprovesburnwounds[J].ArtifOr— gans,2008,32(12),925—931. GuenouH,NissanX,LarcherF,eta1.Humanembryonicstem— cellderivativesforfullreconstructionofthepluristratifiedep— idermis:apreclinicalstudy[J].Lancet,2009,374(9703):1745—1753. TokumotoY.Comparisonofefficiencyofterminaldifferentiationofo1ig0dendr0cytesfrominducedpluripotentstemcellsver— SUSembryonicstemcellsinvitro[J].JournalofBioscienceandBioengineering,2010,109(6):622—628. YamanakaS.AfleshlookatiPScells[J].Cell,2009,137(1):13—17. GarlickJA,FenjvesES.Keratinocytegenetransferandgenetherapy[J].CritRevOralBioled,1996,7(3):204—221. HannaJ.TreatmentofsicklecellanemiamousemodelwithiPScellsgeneratedfromautologousskin[J].Science,2007, 318(5858):1920—1923. WernigM.Neuronsderivedfromreprogrammedfibroblastsfunctionallyintegrateintothefetalbrainandimprovesymptomsof ratswithParkinson'sdisease[J].ProcNatlAcadSciUSA,2008,105(15):5856—5861. ]?]j1:1j1J1;1j]j?"加幻 r}r}r}r;rlrL