豚鼠肠道肌间神经丛内胆碱能神经元的分布

豚鼠肠道肌间神经丛内胆碱能神经元的分布 豚鼠肠道肌间神经丛内胆碱能神经元的分 布 1{8ChinJNeurosci,1999|Vo115'2)-l48,1,50 豚鼠肠道肌问神经丛内胆碱能神经元的分布 巡量叠兀二殷光甫胡道松林传友茹立强' (同济医科大学神经生物学教研室武汉430030) ;?每够(- 摘要应用免疫组织化学技术.研究了不同肠段胆碱乙酰化酶(ChAc)免疫反应性(IR)神经元的分布,拟阐 明胆碱能神经元分布与肠道运动功能的相互关系.结果发现t十二指肠,空肠,回肠,结肠及直肠的ChAc阳性 细胞占总细胞数的百分比分别是:26%.2g,32,l4和l6.小肠胆碱能神经元胞体密度明显高于其他 肠段.小肠胆碱能神经元分布密度较高与肠动力密切相关. 关键词肠神经系统胆碱乙酰化酶免疫组织化学豚鼠齐1}筑 DISTRIBUTIoNoFCHoLINERGICNEURoNSINTHE MYENTERICPLEXUSoFGUINEA—PIGINTESTINAL TRACT YANG13o,CAOFu—Yuan,YINGuang—Fu,HUDgo—Song,LINChuan—You,RULi—Qiang (DepartmemofNeurobiology,Tong~MedicalUniversz'ty,Wu~an430030) ABSTRACTEntericnervoussystem(ENS)isinvolvedindependentlyintheregulationofga stroenteric motility,sensationandendocrine-immunity.Usingimmunohistochemicaltechniques,wee xploredthedistri— butionofcholineacetylase(ChAc)immunoreactivity(IR)neuronsineachsegmentofguinea —pigintestinal tractandtherelationbetweenthedistributionmodelofcholinergicneuronsandentericmotility.Results showedthatthesizeanddensityofmyentericplexusineachintestinalsegmentwerequitedifferent.Theposi— fivecellsdistributingratioofduodenum,jejunum,ileumcolonandrectumwere26%.29,32,14and 16,respectively.Thedensityofcholinergicneuronsinsmallintestinewashigherthanthatinotherseg— meritsofintestinaltractanditsenteticmotilitywasmoreactive.whichhadcloserelationwithentericmotili— ty. KEYWORDSentericnervou~system(ENS)cholineacetylase(ChAc)immun.h15t.chemi8trv guinea—ptg 肠神经系统(entericnervoussystem,ENs)是自 主神经系统的第三成分,它由胃肠道壁内微小神经 节及其神经元组成.ENS可独立参与调节胃肠运 动,感觉,内分泌一免疫等功能.胆碱能神经元具有* 卫生部科学基金课题(99—1—139),负责^ Received1998—11-20Accepted1999r02—11 奋肠道运动的功能,胆碱乙酰化酶(cholineacety— lase,ChAe)是胆碱能神经元的特异标志酶.本文研 究不同肠段ChAc免疫反应性(immunoreactivity. IR)神盎元的分布.拟阐明胆碱能神经元与肠道功能 经丛149 活动的相互关系 供形态学依据. 为胃肠道动力的神经调节机制提攻,每次10rain. 材料和方法 豚鼠5只,雌雄不拘,体重约200g,水合氯醛 (300mg/kg)腹腔麻醉,经主动脉灌注温生理盐水 (37?)150ml冲洗血液,随后用砖的(4c)4多 聚甲醛缓冲液400ml灌注固定,立即切取距幽门5 cm处的十二指肠,肠系膜上动脉静脉支配区域中段 的空肠,距回盲部5cl'f1.处的回肠,升横结肠交界处 的结肠及齿状线上1cm处的直肠各约lcm的肠管 做全部纵肌层撕片,程入2O蔗糖溶液.4?过夜. 撕片标本经0.25TritonX一100预处理(37?)1 h,置入1:4000ChAc的大鼠源性单克隆抗体中 (Incstar公司),经37?2h后,转入4?48h.撕片 出一抗后,置入生物素标记的大鼠源性IgG(Sigma 公司,1;500)中孵育(37?)1h,放入ABC复合物 (Sigma,1:500)1h(37?),最后用硫酸镍铵一葡萄 糖氧化酵一3,3一二氪基联苯胺方法加强显色[]].以 上每一步骤之间均用0.0lmol/LPBS彻底漂洗三 阴性对照:用血清稀释液替代一抗,其余反应步 骤同上.结果对照组中的肠肌层内未见ChAe阳性 成分. ChAc—IR细胞计数:每只豚鼠随机取不同肠段 10个神经丛,分别算出阳性细胞数和经中性红复染 后神经节细胞总数的均数,随后得出5只豚鼠阳性 细胞占细咆总数的百分比.加以比较. 结果 肠撕片ChAc—IR神经元的分布和形态光镜下可 见肠撕片各神经丛大小不等.散在分布.丛与丛之间 有节问束相连神经丛内布满神经节细胞,阳性细胞 成群分布.呈圆形,核周质为蓝色,胞核不着色,有的 可见胞突.其神经纤维也呈蓝色;有的阴性细胞可见 有ChAc阳性纤维末梢围绕其周围.见(图l,5). 各肠段撕片ChAc-IR神经元的密度小肠撕片 ChAc—IR神经元的密度明显高于大肠.睬鼠肠道内 各段ChAc—IR细胞占丛内神经细胞总数的百分比 见表1 Fis1ChAc—lRr.nsinthe duodenumotgultteapig(?) bar=20"m Fig2ChAe—lRneuintheejunum ofguineap(?) bar=20"m Fig3CkAe—IRnsintheileumof guinea—pig(?) bar~20"【 Fig4(1eft)ChAc—lRneuTon~inthe ec,1Onoguineap(?) ' oar=:20 Fig5(right)ChAcIR?inthe rectuIn0guinea—p(?) bar=20"m 15O扬渡曹福元殷光 Totalnumberofganglionicceils NumberofChAc—lRcelts percentage() 4g7 l29 26 502 l46 29 425 137 32 468 66 14 4l9 67 l6 Calculatingrespectivelythe?ofganglionicceltsandChAc— IRcellsof10plexusin8guin~pigs 讨论 ChAc是ACh生物合成酶,也是胆碱能神经元 的特异标志酶,存在于所有胆碱能神经元.ChAc免 疫反应活性被用于鉴别各种组织中的胆碱能神经 元.本研究应用ChAc单克隆抗体免疫组化技 术证明了胆碱能神经元在各段腑道肌间神经丛内的 分布差异. 豚鼠腑道胆碱能及肽能神经的研究已有不少报 道叫】,但大多数局限在回腑,结腑,对腑道各段的 分布差异的比较研究较步本文用ChAc抗体探讨 了不同腑段胆碱能神经元的分布,结果显示小肠胆 碱能神经元的密度较高,结腑的较低.本室曾用 AChE组化法观察到腑道各段AChE强阳性神经元 占神经节细胞总数的百分比为:十二指腑30,空 腑34,回腑37,结腑16,直腑17】两法所 测的胆碱能神经元分布趋势相似,但AChE组化法 的分布比率较高,提示用ChAc高单克隆抗体免疫 组化技术测定胆碱能神经元的方法比AChE组化法 更为精确. 研究表明:有许多因素参与腑道运动的调节,如 兴奋平滑肌的神经元含有ACh和P物质等,可使肌 细胞膜去极化,导致平滑肌收缩【l,而脑啡肽可引 起神经元超极化和降低胆碱能神经快速兴奋性突触 后电位的幅度,抑制平滑肌收缩l3l因此,胆碱能 神经元的多少及功能状态是腑道运动能力强弱的关 键因素小腑运动十分活跃,这与其胆碱能神经元分 布密度较高是密切相关的. 参考文献 1ShuS.JuG,FanL.Theglucose method0tperoxidasehistochemistryofthenervoug systemNeurosciLett,1989I86}169,174 2WangJtJuG.Th—andChAT—immunoreactivee fibersintheanteriorpituitaryofther丑t.ChinJHis— tochemCytochem,l997I6(2):123,189(inChinese) 3EckensteiuF,ThoenenH.Productionofspecif~anti seraandmonoclonalantibodic*tocholineacelyltrans— fe?!characterizationanduseforidentificationof cholinergicneurons.EMBOJ,198211:363~368 4SchemannM,SannH,SchaafC,eta1.1dentJficadon ofeholinergienenroT~inentericnervoussystemby antibodiesagainstcbotineacetyltra~ferase.AmJ Physiot,1993{265(8Pt1)IGl005,1009 5GabeltaGA.Thehumbetofneul~ln5inthesinai1in— tesfineofguin~一pigsandsheep.Neuroscience,1989; 22:737~752 6YoungHM.FurnessJB,Se~eltPta1.Totalhum— hersofneul'(insinmysntericgangliaoftheguinea—pig smallintestine.CdITissRes,19934272『197,800 7BaylissWM—StarlingEH.Theen伯andinner— rationofthesmalIintestine.JPhysloI.1989,84:g9, 143 8WuHJ.LincY.HuDS,"a1.DistributionofNos. 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