褪黑素对体外培养大鼠牙乳头细胞增殖和分化的影响

褪黑素对体外培养大鼠牙乳头细胞增殖和分化的影响 中山大学 硕士学位论文褪黑素对体外培养大鼠牙乳头细胞增殖和分化的影响 姓名:刘洁 申请学位级别:硕士 专业:口腔临床医学 指导教师:黄芳 20100517 中山大学硕士学位论文 褪黑素对体外培养大鼠牙乳头细胞增殖和分化的影响 褪黑素对体外培养大鼠牙乳头细胞 增殖和分化的影响 研究生:刘洁 导师:黄芳副主任医师 专业:口腔临床医学 中文摘要 褪黑素(,,,,,,,,,，,,)是一种吲哚胺类神经内分泌激素，在人和哺乳动物主要由松果体分泌，接受中枢神经系统下丘脑视交叉神经上核(,,,,,,,,,,(,,,,; ,,;,,,，,,,)的调控。,,,(松果体(,,系统主要调控机体的生物节律，以往研究发现,,,参与调控牙本质的节律性形成;也有学者提出巨牙症可能与松果体肥大及褪黑素分泌异常有关;最新研究发现成釉器细胞及成牙本质细胞达褪黑素受体,,，。褪黑素是否参与牙齿的发育值得探讨。 褪黑素的生物学作用广泛，除调节昼夜节律外，还可抗氧化、抗衰老，抗肿瘤，调节生长发育，增强免疫力等。近年来发现褪黑素具有调节骨代谢的作用，能够促进骨质形成、骨折愈合及牙种植体周围的骨整合;体外可促进成骨细胞的分化，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。因此，褪黑素可能是除甲状旁腺素外又一与钙调节有关的激素。牙本质的形成与骨质相似，均为细胞外基质蛋白分泌及羟基磷灰石沉积的过程，因此我们推测褪黑素在牙本质形成过程中也可能起作用。 牙乳头细胞(,,,,,, ,,,,,,, ;,,,,，,,,,)是未分化的外胚问充质细胞，是牙髓细胞与成牙本质细胞共同的前体细胞，参与牙本质的形成及修复过程，在牙齿发育及牙髓损伤修复中发挥重要作用。本实验通过体外培养大鼠牙乳头细胞(,,,,,,,,, ,,,,,,,;,,,,，,,,,,)，观察褪黑素受体,,，、,，”,在,,,,,中的表达分布，研究褪黑素对体外培养,,,,,增殖、分化的影响，并进一步观察,,受体拮抗 ， 中山大学硕士学位论文 褪黑素对体外培养大鼠牙乳头细胞增殖和分化的影响剂,,,,,,,,,对,,作用的影响，初步探讨其作用机制。研究目的: 检测体外培养,,,,,是否表达褪黑素受体,,～、,,,;研究生理浓度褪黑素对,,,,,增殖、分化的影响，并进一步观察,,受体拮抗剂对其作用的影响，初步探讨其作用机制。研究: ,(,,大鼠牙乳头细胞的分离培养:采用组织块法分离培养新生,天,,大鼠下颌第一磨牙牙乳头细胞，差别消化法纯化细胞。 ,(免疫细胞化学技术检测褪黑素受体,,，、,,,在,,,,,中的表达分布。 ,(,,,比色法检测生理浓度褪黑素对,,,,,增殖的影响:?检测普通培养条件下，不同生理浓度褪黑素:,,,,,,,,(低浓度组)、,,舢,,,,,(中浓度组)、,,„,,,,,,(高浓度组)，在作用,,,、,,,、,,,、,,,后各组,,,,,的,,,,,,,值，并计算各组,,,,,的增殖率。对照组不加褪黑素。?在矿化诱导条件下检测褪黑素对,,,,,增殖的影响，检测指标同上。?在以上两种条件下，中浓度组加入褪黑素受体拮抗剂,,,,,,, ,,,,,,,,,，,,,、,,,后检测两组,,,,,啪值有无变化。 ,(,,,,,分化实验:?,,,活性检测试剂盒检测不同浓度褪黑素作用,天后，各组,,,,,的,,,活性(,,,,,啪值)。并在高浓度组加褪黑素受体拮抗剂,,,,,,,,,(,,,,,,,,,)，观察,,,,,,,值有无变化。?免疫细胞化学染色检测,, (,,,,,,,,)对,,,,, ,,,表达的影响:实验分为普通培养组、矿化诱导组、褪黑素组、阴性对照组(,, ,替代一抗)。按实验分组加药,天后，免疫细胞化学检测,,,的表达。?,,,,,,,,和茜素红矿化结节染色检测,,(,,墙,,,,,)对,,,,,体外矿化结节形成的影响:实验分为普通培养组、矿化诱导组、褪黑素组。按实验分组诱导,,天后，分别进行,,,,,,,,和茜素红矿化结节染色。茜素红染色后，,,盐酸酒精处理,,,,，酶标仪检测各组,,,,,椭值。结果: ,(组织块法及差别消化法可得到纯化的牙乳头细胞。 ,(,,,,,表达褪黑素受体,,,，不表达,,,。 中山大学硕士学位论文 褪黑素对体外培养大鼠牙乳头细胞增殖和分化的影响 ,(,,,,,增殖实验:?普通培养条件下加药,,,，各组细胞间的增殖率无明显差异:,,,后，高浓度组低于其它三组(,,,(砸);,,,后，中、高浓度组低于对照组及低浓度组(,姐?);,,,后，实验组均低于对照组(,姐酊)，且高浓度组低于中、低浓度组。?矿化诱导条件下，在所有时间点，中、高浓度组增殖率均低于对照组及低浓度组(,,礁?);,,,后，低浓度组增殖率有下降趋势;,,,后，低浓度组明显低于对照组(,,,(,,)。?在以上两种培养条件下，中浓度组中加入褪黑素受体拮抗剂后，增殖率无明显变化(,??)。 ,(,,,,,分化实验:?,,,活性检测:高浓度组,,值高于对照组仞姐彷)，加入拮抗剂,,,,,,,,,后，,,值变化不明显(,加?)。?,,,免疫细胞化学染色显示:普通培养组染色阴性，矿化诱导组染色弱阳性，褪黑素组染色强阳性。?,,,,,,,,染色:矿化诱导组与,,,,,,,,褪黑素组均可见红色结节染色，普通培养组无明显结节形成;茜素红染色，两实验组,,值均高于对照组(,刘(,,)，但实验组之间无差异(,,,?)。结论: ,(本实验采用组织块法体外成功培养了大鼠牙乳头细胞，并用差别消化法获得了纯化大鼠牙乳头细胞。 ,(普通培养及矿化诱导条件下生理浓度的褪黑素均可抑制大鼠牙乳头细胞的增殖，并呈剂量依赖性。 ,(褪黑素可增强大鼠牙乳头细胞,,,活性，促进大鼠牙乳头细胞,,,表达，为进一步研究褪黑素促进大鼠牙乳头细胞分化提供依据。 ,(大鼠牙乳头细胞表面表达褪黑素受体,,，，但褪黑素受体拮抗剂不影响其作用，提示褪黑素对大鼠牙乳头细胞的作用可能不是通过,,，受体介导。关键词:褪黑素;褪黑素受体;大鼠牙乳头细胞;增殖;分化 ，，， 中山大学硕士学位论文 褪黑素对体外培养大鼠牙乳头细胞增殖和分化的影响 ,,, ,,,,;,, ,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,, ;,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,:,,, ,,, ,,,,,,;,,,,,,,,,,(,,),, , ,,,, ,, ,,,,,,,,,,,;,,,, ,,,,,,,(，, ,,,,, ,,, ,,,,,,,，,, ,,,,,,,;,, ,,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,, ,,,,,(,,),,,, , ,,,,,, ;,,;,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,, ,,, ;,,,,,, ;,,;,,,,, ,,;,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,;,,,,,,,,; 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,,;,,,，,,,)的调控。哺乳动物视交叉神经上核(,,,)是下丘脑前部的一对小核团，在日节律定时系统中是居主导地位的日起律器 (,,,;,,,,, ,,;,,,,,,)，它可以自发地产生节律性的放电和代谢活动【,,】。在觉醒状态下，随着白昼和黑夜交替，光感信息通过视网膜视丘束(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,(,,,)和下丘脑,,,将节奏信息传至松果体，松果体将来自,,,的神经信号转换为内分泌信号，节律性的分泌褪黑素，夜高昼低。,,,一松果体一,,轴调控着机体的生物节律，包括昼夜节律、体温节律、饮食节律、激素分泌节律等【,,,。 , 中山大学硕士学位论文 褪黑素对体外培养大鼠牙乳头细胞增殖和分化的影响牙齿的发育也具有一定的节律性，在牙釉质表现为釉质横纹，在牙本质表现为牙本质生长线„,,，,,,，釉质横纹及牙本质生长线均代表一天中釉质及牙本质的形成量，且在一天中形成的硬组织包括矿化度较高的明带及矿化度低的暗带【,,】，提示牙齿的发育可能与某些激素的昼夜节律有关。,,, ,,,,,,,,，,,,,〔,,】等研究发现若将,,,,,周龄的,,,,,,大鼠的,,,完全破坏后牙本质的日节律性消失;若其,,,部分破坏或单侧破坏，牙本质形成的日节律性暂时性消失，一段时间后又可恢复，提示,,,可能参与调节牙本质的节律性形成。 其次，有学者提出巨牙症的形成可能与松果体肥大有关【,,,，这种观点的提出基于对,,,,,,,,,,,,,,,,,综合症的研究。该病是一种因胰岛素受体基因突变而导致的常染色体隐性遗传病瞄】，在临床上极为罕见。,,,,,,和,,,,,,,,,,于,,,,年首次报道【,刀，至今国内外共报道,,余例，其中国内仅,例。其主要的临床症状为:胰岛素抵抗性糖尿病、牙齿萌出及发育异常、黑棘皮病、多毛症、外生殖器增生肥大、性早熟、松果体肥大、腹部彭隆等，有些伴肾脏损伤。其中口腔内的表现主要有:?乳恒牙的早萌:乳牙多在婴儿,个月开始萌出，,岁即进入替牙期;?巨牙症;?牙齿矿化不全;?多发龋病;?咬合紊乱:颌骨“,??字形，牙列拥挤等〔,,,。,,,,,,,,,,,,,,,,,综合症的患者松果体异常肥大，称重可达,,,,,(正常,,,,,,)【,,,，也有学者检测到褪黑素代谢产物水平异常。褪黑素具有使皮肤褪色、抑制生殖系统发育等作用，而黑棘皮病、多毛症、生殖器肥大等症状均可能与松果体肥大及褪黑素水平异常有关。因此，有学者提出松果体及褪黑素水平的异常可能是,,,,,,(,,,,,,,,,,综合症的发病因素之一瞄,。鉴于此，我们推测牙齿的萌出及发育异常也可能与松果体及褪黑素水平异常有关。 近年来研究还发现褪黑素具有调节骨代谢的作用。褪黑素水平降低与青少年特发性脊柱侧凸的形成有关，去除松果体的幼鸡、鱼等形成的脊柱侧凸与人特发性的脊柱侧凸极为相似，外源性给予褪谒乜苫航饧怪 嗤沟男纬伞玻常埃薄,屎谒厮 较陆祷箍赡懿斡刖 蟾九 侵适杷芍?男纬桑保场А,芯糠?滞屎谒鼐哂写俳 侵市纬傻墓δ埽 ?稍し蓝嘀衷 虻贾碌牡透蒲 ??侵适杷芍?龋簦梗省,屎谒靥逋饪梢源俳 晒窍赴 姆只 翱蠡 ?种破乒窍赴 幕钚裕 醒д咄撇馔屎谒乜赡苁浅 鬃磁韵偎匾酝饬硪恢钟敫频鹘谟泄氐募ち遥常玻省?目前，褪黑素在口腔医学中的研究也日益受到关注，其可促进种植体周围的 , 中山大学硕士学位论文 褪黑素对体外培养大鼠牙乳头细胞增殖和分化的影响骨整合〔,,，,,〕、促进颌骨骨折的愈合，并有希望应用于颌骨肿瘤术后骨修复、牵张成骨术等治疗过程中,, ,„。最新研究发现成釉器细胞及成牙本质 细胞表面有褪黑素受体,,，的表达，提示褪黑素可能参与牙齿生长发育【,,,。 牙本质的形成与骨形成均为细胞外基质蛋白分泌及羟基磷灰石沉积的过程。因此，我们推测褪黑素在牙本质形成过程中可能起到一定的促进作用。牙乳头细胞(,,,,,, ,,,,,,, ;,,,, ,,,,)是未分化的外胚间充质细胞，是成牙本质细胞的前体细胞，参与牙本质的形成及修复过程，在牙齿发育及牙髓损伤修复过程中发挥着重要作用,,,，,,,。因此，本实验通过体外培养大鼠牙乳头细胞，观察褪黑素受体,,，、,,,在大鼠牙乳头细胞中的表达分布，研究生理浓度褪黑素对体外培养大鼠牙乳头细胞增殖、分化及矿化的影响，并进一步观察褪黑素膜受体拮抗剂,,,,,,,,,对其作用的影响。以期为牙齿发育、牙髓损伤修复、牙齿组织等研究提供新思路，并为,,,,,,(,,,,,,,,,,综合症的病因学研究提供实验依据。 , 中山大学硕士学位论文 褪黑素对体外培养大鼠牙乳头细胞增殖和分化的影响 实验一大鼠牙乳头细胞的分离培养 牙乳头.