肿瘤坏死因子受体在肾小球系膜细胞中的基因表达及蛋白合成

肿瘤坏死因子受体在肾小球系膜细胞中的基因达及蛋白合成 肿瘤坏死因子受体在肾小球系膜细胞中 3 的基因表达及蛋白合成 刘 吉吉 邹万忠 ( ) ( ) α α摘 要 探讨肿瘤坏死因子TN F2对肾小球系膜细胞 MC作用的机理 。 目的 :方 ( ) 法 :逆转录2多聚酶链反应 R T2PCR、原位杂交和免疫组织化学方法检测培养大鼠和人 MC 肿瘤 ( ) 坏死因子 ?型受体 TN F2R1的基因表达及蛋白合成 ;原位杂交方法观察 5 例系膜增生性肾小球 肾炎肾穿刺组织的 TN F2R1 基因表达 。 结果 :培养的大鼠和人 MC 有 TN F2R1 mRNA 的表达 并有 TN F2R1 蛋白的合成 , 系膜增生性肾小球肾炎增生的 MC 内有 TN F2R1 表达 。 结论 : αTN F2通过与 MC 表面特异性受体相结合而发挥作用 。 关键词 肿瘤坏死因子受体 肾小球系膜细胞 逆转录2多聚酶链反应 中图法分类号 R32912 Q753 ( α) α 肿瘤坏死因子TN F是一种主要由,L CA 及 T 、B 淋巴细胞标记阴性 ,证实为性 单核巨噬细胞产生的细胞因子 , 已经 单核巨噬细胞 。α( ) TN F对肾小球系膜细胞 MC有明显的促 ( )113 逆转录2多聚酶链反应 R T2PCR 1 α增生作用,为探讨 MC 对 TN F2反应的机 11311 细胞总 RNA 的提取 用培养第 3理 ,本研究采用 R T2PCR 、原位杂交 、免疫组 代的大鼠及人 MC 及大鼠单核巨噬细胞 ,以织化学等方法 ,从基因表达及蛋白合成水平 ( ) 异硫氰酸胍一步法提取 ,经紫外分光光度计 上探讨 TN F ?型受体 TN F2R1与 MC 的 关系 。 测定 , A 260/ A 280 在 118,210 之间 ,并经 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定 , 所提取的 RNA 较纯 ,无明显降解 。 1 材料和方法11312 PCR 引物的与合成 根据已发 2 111 MC 的培养与鉴定 表的 TN F2R1 核酸序列设计 ,上下游引物 鼠肾取自 SD 雄 ( ) 序列为 : 性大鼠 150 ,200 g,北京医科大学动物部 5′2CCA TC T GC T GCACCAA GT GCCA23′提供 。人肾取自一位 64 岁男性肾癌患者的 手术标本远离病灶的健康肾皮质 。MC 的培 5′2AA TCC T GC GT GGCA GT TACACA23′ 1 两引物间 cDNA 序列位于 404,751 nt ,长 养及鉴定方法按本实验室常规方法进行。 112 大鼠单核巨噬细胞的提取及鉴定 为 进度为 347 bp 。 α行产生 TN F2的细胞对照而设置 。SD 大 ( )11313 逆转录 R T 提取的总 RNA 由下() 鼠200 g, 腹腔注射 5 ml 3 % 硫乙醇酸钠 游引物引导 , AMV 逆转录酶 42 ? 作用 30( ) Sigma,4 d 后腹腔灌洗收集细胞 , 每只大 6 min 。( ) 鼠可获取单核巨噬细胞 100 , 120 ×10 ( ) 11314 多聚酶链反应 PCR 逆转录产物α个 。免疫组织化学鉴定 CD68 、12AC T 阳 由上下游引物引导 , Taq DNA 聚合酶催化 , 变性 94 ?50 s ,退火 60 ?60 s ,延伸 72 ?30 ( )3 国家自然科学基金课题39470283 s ,循环 30 个周期 。115 % 琼脂糖凝胶电泳 ( )北京医科大学 病理系北京 ,100083 鉴定 PCR 产物 。 果2 结 114 原位杂交 11411 TN F2R1 cDNA 探针的合成 11 R T2PCR 检测 TN F2R1 mRNA 表达 2将含 TN F2R1 cDNA 的质粒 P T7 hu 大鼠 在大鼠单核巨噬细胞、大鼠及人 MC 均有一 TN FB P ( 条长 347 bp 的明显的特异扩增条带 ,与设计 澳大利亚 Bender Wein 的 Aldolf Himmler ) 的 TN F 2R1 cDNA 序列长度一致 ,多次重复教授惠赠转化 、提取 、纯化及限制性内切酶 MC 。以酶切鉴定后的质粒为 ,底物中 , 从 而 证 明 培 养 的实验 结 果 一 致 有 () ) ( 掺入 bio2112dU TP 北京医科大学药学院, TN F2R1 mRNA 的表达 图 1。TN F2R1 特异性引物引导 , 94 ? 50 s , 55 ? 60 s , 72 ? 30 s , 35 个循环 , PCR 方法合成 cDNA 探针 。 11412 细 胞 涂 片 的 制 备培 养 细 胞 经 0104 % ED TA 消化后涂片 ,4 % 多聚甲醛固 定 15 min 。另将提取的大鼠单核巨噬细胞 制作涂片 。 11413 原位杂交 取大鼠和人 MC ,大鼠单 核巨噬细胞涂片 ,以及 5 例系膜增生性肾小 球肾炎的肾穿刺冰冻切片 , 118 % HO甲醇 2 2 37 ?30 min ,011 mol/ L 盐酸 5 min ,215 mg/ L 蛋白酶 K 37 ?15 min ,70 % 甲酰胺/ 1 × SSC 40 ? 变性 15 min , - 20 ? 冷乙醇梯度 μ脱水 。每张片滴加 20 l 杂交液 , 其中含变 性 cDNA 探针 50 ng ,10 % 甲酰胺 ,015 g/ L 图 1 R T2PCR 检测 TN F2R1 mRNA 鲑鱼精 DNA , 215 ×Denhardt 液 , 10 % 硫酸 在大鼠和人 MC 中的表达 葡聚糖 ,0105 mol/ L D T T ,2 ×SSC , 10 U RN A11002ladder 标记 B1 人 MC C1 大鼠 MC asin ,盖上硅化盖玻片 ,37 ?孵育 24 h 。去除 盖玻片 ,2 ×SSC , 1 ×SSC , 015 ×SSC 及 PB S (冲洗后滴加 1?1 000 St rep tavidin/ HR P J ack2 ) so n Immuno research L ab , U SA 37 ? 30 min 。PB S 冲洗后 DAB 显色 。本实验以大 鼠单核巨噬细胞原位杂交为阳性对照 ,空白 对照杂交液不加探针 。 15 1 免 疫 组 织 化 学取 前 述 细 胞 涂 片 , L SAB 法常规操作 。一抗为 TN F2R1 多克隆 a b ( ) 抗体 山羊抗人 , R & D,二抗为 1 ?400 生 物素化的兔抗山羊抗体 , 三抗为 1 ?1000 图 2 原位杂交检测 TN F2R1 mRNA ()在大鼠和人 MC 中的表达 400 × St rep tavidin/ HR P 。本实验以大鼠单核巨噬 A1 大鼠 MC B1 人 MC 细胞为阳性对照 , 空白对照以 PB S 代替一 抗 。 () 212 原位杂交 大鼠及人 MC 与大鼠单核 图 3。 巨噬细胞一样 , 明显有 TN F21 mRNA 的表 213 免疫组织化学 培养的大鼠和人 MC ( () 达图 2。5 例系膜增生性肾小球肾炎 , 在 与单核巨噬细胞一样有 TN F2R1 合成 图 ) 4。增生的 MC 内均可见 TN F2R1 mRNA 表达 图 3 原位杂交检测 TN F2R1 mRNA 在人系膜 图 4 免疫组织化学检测 TN F2R1 ()()增生性肾小球肾炎的 MC 中的表达 400 × 在大鼠和人 MC 中的合成 400 × A1 大鼠 MC B1 人 MC 为研究对象 。 本研究从分子病理学和免疫 细胞化学水 论3 讨 平证实 MC 有 TN F2R1 的基因表达和蛋白 ( ) 肾小球系膜细胞 MC是肾小球中最活合成 ,从而证明 MC 可以通过其表面特异性 跃的固有细胞成分 ,具有许多重要的生理功α受体接受 TN F的作用 ,也从另一侧面提示 3 能。体内外多种物质包括细菌内毒素 、免αTN F在增生性肾小球肾炎的病理过程中 , 疫复合物 、高级糖基化终末产物 、多种炎性介很可能是一个重要的作用因子 。 质和细胞因子等都可导致 MC 增生 。在各 种增生性肾小球肾炎和肾小球疾病中 ,都可 看到系膜细胞增生和系膜基质增多 ,有时原 参 考 文 献始病因虽去除 ,该病理改变仍可继续进行 ,最 1 董 葆 ,邹万忠 ,由江峰 1 肾小球系膜细胞增生与硬化 终导致肾小球结构和功能的严重破坏 ,引起 机制的初步探讨 1 中华病理学杂志 ,1994 ;25 :104 ,6 肾小球硬化。 Himmler A , Maurer2Fogy I , Adolf GR et al . Molecular 2 αTN F2是细胞因子大家族中一成员 ,主 clo ning and exp ressio n of human and rat t umo r necro sis ( ) facto r recepto r chain P60 and it s soluble derivative , t u2 要由单核巨噬细胞产生 ,增生的 MC 也可产 mo r necro sis facto r2binding p rotein . DNA and Cell Biolo2 α生 TN F2。在多种肾小球肾炎中 , 肾组织 gy , 1990 ;9 :705 αα TN F2表达量升高 。TN F2各种生物活性 3 邹万忠 1 肾脏病理与临床 1 湖南 : 科学技术出版社 , 的发挥 ,都要通过其与靶细胞表面特异性受 1993 :18,19( ) 体 TN F2R结合来完成 。TN F2R 分为两型 , Kashgar M , Sterzel RB. The pat ho biology of t he 4 ( ) ?型受体 TN F2R1传导 TN F 大量生物活 mesangium. Kidney Int ,1992 ;41 :524 性 ,如细胞毒性和诱导多种基因表达 , 而 ? 5 Davies M . The mesangial cell : A tissue cult ure view . Kid2 ( ) 型受体 TN F2R2只传导信号使初级胸腺细 ney Int , 1994 ;45 :320 胞和毒性 T 细胞增生 ,所以我们以 TN F2R1 Baud L , Ardaillo n R. Tumo r necro sis facto r in renal in2 6 jury. Mineral and Elect rolyte Metabolism ,1995 ;21 :336 ( )1996 —11 —25 收稿 ,1997 —02 —15 修回 ( )本文编辑 刘启成 ABSTRACTS OF O RIGINAL A RTICAL S D EMO GRAP HIC INVESTIGATIO N OF GLOM ERUL A R D ISEASES IN C HINESE AD UL TS L i L eis hi , Gu an T i anj u n , L i u Zhi hong , Y u Y us hen g , T an g Zheng , Chen Hui pi ng , W an g Q i n gw en , Y ao X i aod an ( )Resea rch I nst i t ute of N ep h rology , J i nl i ng Hos pi t al N anji n g , 210002 OBJECTIVE To investigate t he demograp hic feat ures of glo merular diseases in Chinese adult s. ( ) METHODOLO GY There were 4 298 adult patient s > 15 years of ageunderwent successive native kidney biop2 ( ) sies t he minimum number of glo meruli ?10and had definite pat hologic diagnosis in our instit ute bet ween J anuary1980 and December 1996 . The demograp hic feat ures of t his group of patient s has been analyzed in t his st udy. ( ) ( ) RESUL TS Amo ng t he 4 298 patient s , p rimary glo merulo nep hritis P GNis t he most f requent t ype 7618 %, ( ) ( ) followed by seco ndary glo merulo nep hritis S GN , 2218 %and hereditary nep hropat hies HN , 014 %. In patient s ( )wit h P GN , t he male to female ratio is 1181?1 , while in S GN it is 0146?1 . Immunoglobulin A nep hropat hy IgAN accounted for 3619 % which was t he most co mmo n form of P GN , followed by mesangial p roliferative glo meru2 () () () lo nep hritis 2917 %, membranous nep hropat hy 818 %, immunoglobulin M nep hropat hy 716 %, membranop ro2 ( ) ( ) liferative glo merulo nep hritis 518 %, focal segmental glo merular sclerosis 516 %, endocapillary p roliferative () ( ) ( ) glo merulo nep hritis215 %, minimal2change disease 213 %and crescentic glo merulo nep hritis 018 %amo ng pa2 () tient s wit h P GN . L up us nep hritis L Naccounted for 6317 % which was t he most f requent t ype of S GN , followed ( ) ( ) by nep hropat hies of Henoch2Schnlein p urp ura 1113 %, diabetic nep hropat hy 617 %and systemic vasculitic ö () nep hropat hies 518 %in patient s wit h S GN . Patient s aged 2534 years accounted for t he highest percentages bot h in P GN and S GN in t his group of patient s at renal biop sy. CO NCL USIO N For adult patient s wit h glo merular diseases in China , t he patient s wit h P GN account for 7618 % while patient s wit h S GN for 2218 %. IgAN is t he most co mmo n form of P GN and L N is t he most co mmo n type of S GN . Male patient s p redo minant in P GN and female in S GN . Most of t hese patient s p resent t he diseases and had renal biop sy at 25,34 years of age. Key words demograp hy glo merulo nep hritis pat hology GENE EXP RESSIO N A ND P ROTEIN SY NTHESIS OF TUMO R NECROSIS FACTO R RECEP2 TO R IN GLOM ERUL A R M ESA NGIAL CELLS L i u Zhe , Zou W anz hong ( )Depa rt ment of Pat hology , Beiji n g M edi al U ni versi t y Beiji n g , 100083 ( ) OBJECTIVE Glo merular mesangial cell MCis an active int rinsic glo merular cell . Proliferatio n of MC is t he major ( ) pat hologic change in glo merular diseases. Cyto kines including t umor necrosis factor TN Fplay pivotal roles in MC p roliferatio n and pat hogenesis of glo merulo nep hritis. The mechanism by which TN F affect s MC and it s correlatio n ( ) wit h t he t ype 1 TN F recep tor TN F2R1were investigated in t his st udy. METHODOLO GY Rat and human MCs were separated and cult ured. R T2PCR was used to detected t he exp res2 sio n of TN F2R1 mRNA in cult ured rat and human MCs. Rat mo no nuclear macrop hages were used as t he co nt rol . Renal biop sy specimen f ro m 5 patient s wit h mesangiop roliferative glo merulo nep hritis were collected. The exp ressio n of TN F2R1 mRNA in human renal biop sy specimen was detected by in sit u hybridizatio n. To determine t he p rotein synt hesis of TN F2R1 in MC , immuno histochemist ry met hod was used in cult ured MC. RESUL TS The exp ressio n of TN F2R1 mRNA p resented in cult ured rat and human MCs as well as in t he mesangial area in patient s wit h mesangiop roliferative glo merulo nep hritis. Besides , t he capabilit y of p rotein synt hesis of TN F2 R1 in MC was p roved. CO NCL USIO N The exp ressio n of TN F2R1 mRNA and p rotein p resented in t he MC , it is indicate t hat TN F might affect MC’s f unctio n t hrough it s specific recep tor . Key words t umor necrosis factor recep tor glo merular mesangial cell R T2PCR