癌变过程中肝总RNA和嘌呤代谢酶的表达与动态改变

癌变过程中肝总RNA和嘌呤代谢酶的达与动态改变 癌变过程中肝总RNA和嘌呤代谢酶的表达 与动态改变 一 r 19卷第6 癌变过程中肝总RNA和嘌呤代谢酶的表达 与动态改变 姚登福是玮乙/衙琪云蒋道荣刘艳华孟宪镛 —, —一 7一,7 【摘要】目的观察腺苷脱氨酶(adenosinedeaminaseADA)和鸟嘌呤酶(gqJanase,GUA)在肝细胞 癌变过程中的表达与动态变化.方法以2一乙酰氪基萄【2FAA)喂饲大鼠诱发肝癌,在肝细胞癌变过 程中,对肝组甥学,总RNA浓度,GUA和ADA活性的动态改变进行丁分析结果大鼠摄^2FAA 后,GUA和,4d)A的活性均迅速升高,并与总RNA椎度呈正相关.在肝细胞娈性至癌前病变阶段,肝和 血ADA明显升高(P<0叭),而后血~ad)A迅速降至正常;血GUA在肝细胞癌变过程中酶活性持续升 高,并与肝GUA相一致,鼠肝完全癌变时酶活性达高峰结论ADA在肝细胞损伤早期比ALT和 GST敏感,GUA括性持续升高婀表示肝病程度严重 【关麓词】肝癌模型肝总RNA鸟嘌呤酶腺苷脱氮酶表达 Expr~,sionandkineticalterationsofhepatic~otalRNAconcentrationandpurinemetal~lice nzymesduring thedevelopmentofrathepatom~YAODengfu,WU仉,TANG口州 n,alAffiliatedHosflital, NantongMedicalCollege,Jiangsu,226001 【Abstrac'lOble~veToobservetheexpressionandkineticalterationofadenosinedeamirtase(ADA) andguanase(GUA)duringthecarcinogensisofratliversMethodsTherathepatichistologicchang~,total RNALevels.GUAandADAactivitieswereobservediaexperimentalrathepatomosinducedby2-FAARe- saltsTheGUAaadADAactivitie~Jncreasodrapidlyintherafedwith2-FAA.andp~sitivecorrelations werefoundbetweenGUAorADAactivityandtotalRNAconcentrationTheactitiesofliveraad蚶? ADAwereoverexpressedandsignificantlyhigher(P<001)inexperimentalratsfromhepatoe.vte&genera— tiontOprecancerousstage,rheaSet'LIITtPd3Aactivitydecreasedtonormallevel;Theincreases0{serui~lGUA levelswereconsonantwithhepaticGUAc~ncentrations.andthemarkedexpressionsofserumGUAand】iver GUA~eeurredathepaoarnastageofe~peritnentalratsConclusionsThepresentdatasuggestthatADAisa moresensitivemarkerthanALTorGsTintheearlystageofhepatoeelluiarinjury.andeverlastingincreaseof GUAimplicates~riousdamageofhepatoeytes 【Keywords】HepatomamodelHepatictotalRNAGuanaseAdenosinedeaminaseEx pression 鸟嘌呤酶(guanase,GUA)和腺苷脱氨酶 (adenosinedeaminase,ADA)在体内分别催化鸟嘌呤 和腺嘌呤核苷酸的脱氨基作用,它们既与生物转化, 核酸代谢及肿瘤发生具有密切关系,又是反映肝细 胞病变的灵敏标志酶_1-3],但在肝细胞损害及癌变 过程中,它们的表达与改变机制尚不清楚.本文以 化学致癌物(2-FAA)喂饲大限,观察了诱癌过程中 肝组织学,总RNA浓度,GUA和ADA表达与动态 变化.以探讨其表达机制和变化规律. 国家教委留学回茸^员课g和南通市科委资助项日 作者单位:226001江苏.南通医学院附属医院 材料与方法 1999,V19.N0.6 ? 论着? 一 ,动物模型制备 雄性SpragueDawly(SD)大鼠(南通医学院实 验动物中心提供)48只,体重140,180g,随机分成 8组,每组6只.任选一组为对照组,给予一般颗粒 饲料,其余各实验组(含备用组)以005%的2-FAA (Sigma)颗粒饲料作恒环境饲养,每2周处死一组, 取外周血作酶恬性测定,取部分肝组织作病理学检 查(HE染色)及肝组织匀浆的制备. 二,肝匀浆的制备 新鲜鼠肝脏,以09%NaC1洗去血迹,吸干并 Jf 999年121999.19.No6 剪碎,称取约150rag加2mlpH70磷酸盐缓冲液 (其中含10mmol巯基乙醇)提取GUA.将肝组织 置玻璃匀浆器中,反复研磨2分钟,丁4C冰箱过 夜.离心15分钟(4.C),取上清液于一20C保存 备用. 三,总RNA提取及其浓度检测 称取肝组织50mg,置于无RNAase的匀浆器 中,加入RNAzole试剂快速提取总RNA,于岛津 uv一2201紫外分光光度计检测RNA吸光度(A260), 并换算出总RNA浓度(p.g/mg湿重肝组织). 四,酶活性分析 鼠血清及肝匀浆上清液.以Berthelot反应检测 ADA总活力(U/L)j,本院建立的酚钠试剂法测定 GUA活性(u/L)肝匀浆上清液以福林酚试剂法 检测蛋白浓度,根据蛋白浓度(g/L)和酶活性(U/ L),计算出酶的比活性(U/g).将酶底物作2,20 倍稀释,分别测定正常鼠血清及肝癌鼠血清GUA 以底物浓度和对应的酶活性单 和ADA活性单位, 位,作图计算出二者的米氏常数.为便于比较,还检 测了血清丙氪酸转氪酶(ALT),7谷氨酰移换酶 (GGT)和谷胱甘肽一S-转移酶(GST)的活性. 五,资料统计和分析 将数据输人计算机,以方差分析统计处理资料, 并进行两两比较. 结果 一 ,肝组织学改变与两种嘌呤酶的表达 肝组织H.E染色后经病理学捡查,总RNA浓 度,ADA和GUA比活性的结果,见表1诱瘟第2 周,鼠肝外表呈灰黄色,表面增粗,镜下显示肝细胞 颗粒变性;第4周半数鼠肝组织学表现为癌前病变. 肝组织结构大部分存在,部分区域可见增生性小圆 细胞或卵圆细胞,少数区域有结节形成趋势;第l0 周时大部分癌变;第12周时全部癌变,组织学上表 现为肝小叶结构破坏,肝组织呈弥漫性片状坏死,可 见大量小圆细胞及整片的癌巢结节,瘟组织多数为 高分化肝细胞肝癌,对照组肝均无上述改变.实验 组随着肝组织学改变的发展.肝总RNA浓度,AJ3A 和GUA活性逐步增加,两种酶的活性与总RNA浓 度呈显着正相关,GUA为r=077(P<001), ADA为r=069(P<001). ,鼠血清中酶活性的动态改变 SD大鼠经2一FAA喂养后,在第2周时血中 GUA活性开始增加,而ADA已明显高于正常对照 组(P<0.01);以后各实验组GUA呈持续增加趋 势.而ADA在高峰维持2周左右后呈逐步下降趋 势.从表2可见,在肝细胞损害的早期,ADA,GUA 活性升高比ALT早2周左右.ADA2周时选高峰, ALT和G盯第4周达高峰,以后则逐步降至较低 水平;而GUA与GGT,在肝细胞癌变过程中持续上 升,当肝细胞完全癌变时达晟高峰. 三,酶动力学常数(Km值) 按双倒数作图法求得对照鼠,实验鼠嘌呤酶催 化反应的Km值,发现在肝细胞癌变前后,它们的 Km值来见改变,GUA均为00603【mMol/L),ADA 均为0332mMol/L. 讨论 酶组化证实人体内GUA分布较集中,主要存 在于肝,肾和脑组织中.对各种肝病组织的对比研 究发现,GUA仅存在于肝细胞的胞浆部分而 ADA则分布较广,以盲肠,小肠粘膜和脾中吉量最 高,肝.M3A浓度仅为小肠组织的7%,10%.且 90%存在于细胞浆的水溶性部分,其余位于肝细胞 表1诱癌过程中鼠肝病理,总RNA及嘌呤酶比活性变化 与对照组比较:*P<005;**P<001:#中速死亡一只 December1999}Vo119L 寰2诱癌过程中血清GUA,ADA活性与其它酶的比较 与对!llI组比较*P(0.05;P(001 核内.核内ADA是与核酸代谢密切有关且浓度较 高的酶之一1.在实验鼠肝细胞癌变早期,病理可 见的小圆或卵圆细胞,具有抵抗致癌剂的细胞毒性 作用,同时又有表达肿瘤相关酶(GGT,GST和ALP 等)或蛋白质(如AFP)的功能.在诱癌阶段肝内总 RNA,GUA和ADA改变明显,可能与嘌呤酶在抗 诱变中的作用有关,可经酶促反应使肝内解毒和转 化功能加强,消除致癌剂等的毒性作用,保护正常细 胞免受启动和促癌因素的影响. 肝细胞损伤,坏死或细胞膜通透性增加时,胞浆 中GUA和ADA可逸人血中,引起酶活力升高,其 增加幅度可反映肝细胞的损害程度J.在诱癌剂 的作用下,肝细胞发生颗粒变性时,血ADA活性已 明显异常,并显着高于正常对照组(P<001),说明 血ADA异常是因肝细胞损伤导致过量肝ADA进 入血液所致,但在诱癌的中后期肝ADA持续增加, 血ADA表现为明显下降或接近正常水平;而在诱 癌整个过程中肝及血GUA持续增加,当肝细胞出 现弥漫性片状坏死,组织学见大量小圆细胞及整片 的癌巢结节时,GUA活也达最高水平.提示ADA 和GUA在肝细胞癌过程中呈现不同的变化规律, 前者在反映肝细胞早期病变方面比GUA敏感,而 后者持续异常则表明肝细胞由损害向恶性病变方向 进展. 肝细胞癌变前后所表达GUA和ADA的动力 学常数相同,说明GUA和ADA分子组成未发生改 变,组织和血中酶活性异常是由于肝细胞的过度表 达及释放增加所致.GUA,ADA与其它酶的对比研 究,发现ADA和GST在反映早期肝细胞病变方面, 明显优于ALT.由于/iDA和GST分子较AlJT为 小,当肝细胞轻度损伤时它们易于进^血中,GST 和ALT达高峰时间迟于ADA;血GUA与肝GUA 的增加具有同步性,提示血GUA直接来自肝组织. 根据肝细胞癌变过程中5种酶的变化规律,可见 GUA在反映急性肝细胞损伤方面不及ADA,GST 和ALT敏感,但GUA持续异常提示肝细胞病变较 严重j.至于在癌变过程中血与肝ADA改变存在 不一致性,可能与ADA参与癌组织中的核酸代谢 有关,但ADA释放并未增加的确切机制还有待深 入探讨. 参考文献 1DurakI,CetinR,CAnbolatO,et.Aden~inedeamiuase,5… deotide.guan~andcyfi~nedeaminaseb?u凹ingastrictissu~ frompatientswRhg~triecatlc.CLett,1994.15:199—200 2CanbolatO.Dur1,CetinR,gtb?口esofadeno~aedea皿 nase,5nueleotid~.guarmse.andcytidinedemxd~eIuin usand[tOllCgtrioei'l~humanbr~sttissuesBreastCnctr ResT侧n.1996.37:189.193 3ItoSGuaa~.NipponRiI-sho,1995.53:296298 4,~mmsD,CizdzEdPE,Chom~nskiPTRLITM:&newr曲e呲 foropdmalngIspisolationofRNAFocus,1993.15:99—102 5MachadoHN,SchenkeIOJ.BerlinFA."atMeasurementof adeno~nede.~alnnseOntheEkmclmmAny盯.ClinChem,1997, 43:123 6.ItoS.MBedaT,1waskiA.gtHistoebemicalandB/ocbemleal studi~onguanaseinthehumanandr&tkidneyAc?}t~bemCy 'ochem.1991.24:591—598 7KohayashlF,IkechT,MarumoF,etAdeno~medeaminase l~nz3maesinlix~erdiseaseAmJG~troentero],1993,88:266270 8ShawT,LiJ,BowdenDS,~dtalSeramguanaseacti~tyinhepatitis CvirasinfectionAdvExpMedBio1.1994.370:475480 (收藕:199805—04謦回:199812—09 (本文嫡辑夏雏新)