精液DNA提取
1.4.1 提取牛冻精基因冻DNA所需冻冻的配制
1.0.5mol/L EDTA,在800ml水中加入186.1g二水乙二四乙酸二冻;胺EDTA-
Na?2H2O,~在磁力冻拌器上冻烈冻拌~用NaOH冻冻溶液的pH冻至8.0~然后定
容至1000ml~分高冻冻菌冻用。装
2.1mol/L Tris?Cl,在800ml水中溶解121.1g Tris碱~加入冻酸冻pH冻至8.0~使
溶液冷至室后~方可最后冻定温pH冻~加水定容至1L~分后高冻冻菌。装
3.10%SDS;十二冻基酸冻,,在磺900ml水中溶解100g的SDS~加冻至68?用
磁力冻拌器冻拌助溶~用HCl冻冻pH至7.2~定容至1L。室~无需冻菌。温
4.20%SDS;十二冻基酸冻,,在磺900ml水中溶解200g的SDS~加冻至68?用
磁力冻拌器冻拌助溶~用HCl冻冻pH至7.2~定容至1L。室~无需冻菌。温
5.生理冻水,取称9克冻化冻~溶解在少量蒸冻水中~稀冻到1000ml。6.2mol/LNaCl,116.88 g NaCl溶于蒸水中~加水定容至双1L~高冻冻菌。7.蛋白冻K(20 mg/ mL),200 mg蛋白冻K溶于10 mL水中~以1 mL分~,装
20 ?冻藏。
8.TE冻液,冲20 mmol/L Tris-HCl;pH8.0,~1 mmol/L EDTA;pH 8.0,;配
方冻2 mL 1 mol/L Tris-HCl,~ 加0.2 mL 0.5 mol/L EDTA~加水定容至100
mL~高冻冻菌。
2.1.1 公牛冻精DNA的提取方法
用高冻法牛冻精中提取基因冻从DNA~步冻如下,
取2mL离心管~放入一支冻精~加入500mL生理冻水~冻旋混~匀12000rpm离心
1min。倒去上液~保留淀;透明的冻精心清沉离12000rpm~2min,。
重冻步冻1一次
向淀中加入沉400μl加入DDT的牛冻精裂解液~向管中加入100μl 20%的SDS~盖上心盖子~放置一~然后冻旋~是淀完全溶于裂解液。再加入离会沉10μl 的
蛋白冻K,冻倒混。匀
将匀混的冻品放入56冻氏度的保箱~消化温4个小冻以上~最好消化冻夜。取消化好的冻品~向心管中加入离300μl 冻和食冻水。冻倒2-3min~放入箱置冰静一。会儿12000rpm心离5-10min。心后的上移到新的心管中~将离清离扔
掉淀。沉
向心管中加入离1000μl冰冻的无水乙醇。冻倒1-2min~然后12000rpm离心2min。倒去上液~保留清DNA沉沉将沉淀。如果所得到的淀冻大~冻需要淀冻入
新的心管~再冻行以下步冻。离
向心管中加入离500μl 75%的乙醇~混;不要冻倒,~然后匀12000rpm离心
2min。倒去上~保留清DNA沉淀。
重冻步冻7一次。
向心管中加入离300μl 56冻氏度的TE;如果淀冻小~冻用沉200TE溶解淀,沉~
56冻氏度冻盖放置十分冻。冻淀溶解。沉
用1%的冻脂糖冻泳冻冻~点冻冻buffer 3μl,冻品2μl。130V冻泳10min。
将冻冻合格的冻品放入-20冻氏度的保存。冰柜