牛干扰素-τ基因的克隆及其在大肠杆菌中的 - 四川

牛干扰素-τ基因的克隆及其在大肠杆菌中的 - 四川 牛干扰素-τ基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达 动物遗传育种与繁殖:管晓斌 指导教师:赖松家 教授 本研究采用克隆测序技术，首次测定了中国荷斯坦奶牛干扰素-τ(bIFN-τ)成熟蛋白基 DQ680847)，并利用生物信息因的编码区(CDS)全序列(GenBank登录号:DQ680846、 学方法对bIFN-τ的结构和功能进行了预测，结果表明: bIFN-τ成熟蛋白基因的CDS全序列长度为519bp，编码172个氨基酸的bIFN-τ。对bIFN-τ成熟蛋白基因的CDS全序列和GenBank上已公布的相关序列进行聚类分析，可将其聚为4类，发现了新的一类bIFN-τ(τ4)和六种新亚型(τ1e、τ3f、τ3g、τ3h、τ4a、τ4b)。DQ680846属于τ4类的一种亚型，标记为τ4a;DQ680847属于τ3类的一种亚型，标记为τ3f。各bIFN-τ基因核苷酸序列间的同源性在92.7%~99.8%之间，推导氨基酸序列间的同源性在88.5%~99.4%之间;τ4a、τ3f与其他bIFN-τ基因核苷酸序列间的同源性分别在94.0%~97.1%、92.9%~99.6%之间，推导氨基酸序列间的同源性分别在91.4%~96.0%、88.5%~99.4%之间。不同物种IFN-τ基因可聚为4类:普通牛与美洲野牛、水牛聚为一类;绵羊、山羊、麝香牛聚为另一类;大额牛、马鹿、麝香鹿聚为第三类;长颈鹿单独为一类。各物种IFN-τ基因核苷酸序列间的同源性在84.6%~99.2%之间，推导氨基酸序列间的同源性在68.4%~97.7%之间;中国荷斯坦奶牛bIFN-τ基因τ4a和τ3f与其他物种IFN-τ基因核苷酸序列间的同源性在87.7%~99.2%之间，推导氨基酸序列间的同源性在74.1%~97.7%之间。对bIFN-τ的结构和功能进行生物信息学预测，发现bIFN-τ氨基酸序列中有一个潜在的N-糖基化位点，Asn78可被糖基化。bIFN-τ中存在5个主要的疏水区，分别位于氨基酸序列的53~68位、75~86位、96~104位、114~121位和139~156位。bIFN-τ氨基酸序列中有6个潜在的磷酸化位点:Ser25、Ser137、Ser153、Ser155、Thr119和Tyr136。bIFN-τ的Cys1和Cys99、Cys29和Cys139各自形成两个二硫键，以维持其立体结构。bIFN-τ的三维结构是以5个α-螺旋为基础构成的，α-螺旋由111个氨基酸残基形成，占64.53%;螺旋之间为无规卷曲，由61个氨基酸残基形成，占35.47%。bIFN-τ氨基酸序列3~155位是包括IFN-α，β，ω，τ，δ等在内的?型IFN家族的典型保守结构功能域。由此可以推测出bIFN-τ具有?型IFN所共有的抗病毒、抗细胞增生、免疫调节等生物学功能。 本研究将bIFN-τ基因定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)中，构建了重组融合表达质粒pET-28a-bIFN-τ，转化大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG诱导表达，优化表达条件，并初步纯化重组融合蛋白，结果表明: bIFN-τ基因在重组融合表达质粒pET-28a-bIFN-τ中的插入方向和读码框均正确;该基因已在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了融合表达，其表达量占菌体总蛋白的20.68%。对表达 ?和30?时进行诱导，融合蛋白的表达量高条件进行了优化，其表达量可达28.84%。在37 于25?和20?时的诱导;在诱导后1h就有融合蛋白表达，诱导后3h融合蛋白的表达量达到峰值。通过固定相金属离子亲和色谱(IMAC)方法纯化重组融合蛋白。咪唑浓度为300~500mmol/L的Elution buffer的纯化效果较好，纯化后的重组融合蛋白的浓度和纯度都很高。 关键词:中国荷斯坦奶牛;干扰素-τ基因;分子克隆;序列分析;生物信息学预 测;融合表达;大肠杆菌;蛋白纯化