根霉菌测定

根霉菌测定 姓名 ,,, , 学号 学院,生命科学学院, 专业 班级, 实验课程名称 ,, 发酵工程学实验 ,,,,, ,,,,, 指导教师及职称 开课时间 2013 至, 2014 学年 第二 学期 云南师范大学教务处编印 实验名称:根霉曲糖化能力的测定 :有 小组合作实验时间: 成员:范艳芬 王余姣 星期三1-2节 杨艳红 卢飞燕 一、实验预习 1、实验目的 (1)了解糖化酶的测定方法; (2)对糖化酶的糖化产物及糖化DE的计算; (3)了解根霉曲在发酵生产过程中主要应用依据。 2、实验设备及材料 材料:根霉曲、柠檬酸缓冲液、DNS、1%淀粉 设备:天平、烧杯、三角瓶、水浴锅、离心机、722分光光度计等。 3、实验原理: 淀粉是由葡萄糖通过α-1,4糖苷键构成的直、链淀粉和α-1,6位有分支的支链淀粉组成的，直链淀粉约含100-6000个葡萄糖单位，支链淀粉平均含6000个以上的葡萄糖单位，最高可达300万。 淀粉酶首先酶解淀粉为小分子的糊精、寡糖和少量单糖。 通过糖化酶的作用将小分子的糊精和寡糖降低为还原性的单糖。 4、实验方法步骤及注意事项: 1)、绘制曲线的方法 先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。 以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。 然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。 0.1%葡萄糖标准曲线的制作 取7支试管，编号，按照下进行操作: 葡萄糖溶液 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 体积(ml) 葡萄糖含量(mg) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 缓冲液(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 DNS (ml) 3 3 3 3 3 3 3 定容总体积(ml) 15 15 15 15 15 15 15 OD(540nm) 0 0.104 0.232 0.428 0.675 0.914 2)、酶液的制备 取1克根霉曲溶解到30毫升缓冲液中，混合搅拌10分钟，纱布过滤，取过滤液备用。 3)、糖化酶酶活测定 取酶液按照下表要求操作测定酶活 操作步骤 空白管 样品管A 样品管B 吸取1.8mL淀粉底物溶吸取1.8mL淀粉底物溶吸取1.8mL淀粉底物溶步骤1 液 液 液 步骤2 50?保温5分钟 50?保温5分钟 50?保温5分钟 步骤3 加入待测酶液0.2毫升 加入待测酶液0.2毫升 步骤4 50?精确保温10min 50?精确保温10min 50?精确保温10min 加入3mLDNS试剂终止加入3mLDNS试剂终止加入3mLDNS试剂终止步骤5 反应 反应 反应 步骤6 混合均匀 混合均匀 混合均匀 加入0.2毫升待测酶步骤7 沸水浴煮沸5min 沸水浴煮沸5min 液，沸水浴煮沸5min 步骤8 流水冷却 流水冷却 流水冷却 步骤9 加蒸馏水10mL，混匀 加蒸馏水10mL，混匀 加蒸馏水10mL，混匀 步骤10 ODnm比色 ODnm比色 ODnm比色 540540540 OD =(A+B)/ 2 4)、淀粉酶的液化效果试验 取一只试管装入1毫升1%浓度的淀粉底物，50?预热5分钟，加入酶液1毫升，反应5分钟，取5毫升稀碘液检测淀粉显色情况。 5)、记录试验现象和注意事项 酶活测定注意事项 试管上编号:贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落; 移液枪的使用:向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连 续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头～ 精确记时:每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理; 避免试管进水:煮沸和用流水冲洗时。 二、实验内容 1、实验现象、数据及观察结果 (1)、糖化酶酶活测定实验结果: 第一组:ODnm=(A+,),2,(0.752，0.815),2,0.7835; 540 第二组:ODnm=(A+,),2,(0.746，0.667),2,0.7065。 540 (2)、淀粉酶的液化效果试验结果:试管内液体颜色不变蓝。 (3)、绘制标准曲线: 1.2 y = 0.8701x + 0.210812R = 0.9976 0.8 系列10.6线性 (系列1)c浓度 0.4 0.2 0 00.20.40.60.81 A值 根据公式 E酶活力单位(U/ml)= {K[ (ODA + ODB ) /2] + b}×5×10×1000/10/0.2/1/180 将y=0.8701x+0.2108代入得出 第一组E=60*(0.8701*0.7835+0.2108)*5*10*1000/10/0.2/180=7437.72 ; 第二组E=60*(0.8701*0.7065+0.2108)*5*10*1000/10/0.2/180=6879.36 2、对实验现象、数据及观察结果的与讨论: (1)、糖化酶酶活测定实验 根据实验数据可以得出，我们制作的两组实验还是相当成功的，他们的酶活性都很高，都达到0.7以上。 (2)、淀粉酶的液化效果试验 因为试管中的淀粉底物都被酶液中的酶分解完全了，淀粉酶首先酶解淀粉为小分子的糊精、寡糖和少量单糖，通过糖化酶的作用将小分子的糊精和寡糖降低为还原性的单糖，试管内已经没有淀粉了，碘液只有遇到淀粉才变蓝，所以最终试管内液体不变蓝。 (3)、绘制标准曲线 由于实验误差，得到的标准曲线也不怎么标准。 3、思考: 为什么要严格控制时间, 答:因为时间的长短不一，就会造成酶活性不同，那实验就会有多变量因素， 实验数据无法精确得出，实验误差就会很大，则实验就失败了。 三、实验小结 本次实验成败之处及其原因分析、改进措施: 成功之处:我们做出的根霉的活性很高。 不足之处:在制作标准曲线过程中，我们小组的540nm下OD值不高。我们在测定时对实验不熟悉，没法判断出正确与否。 改进措施:实验前预习，严格按照实验步骤做实验。 指导老师评语及得分: 签名: 年 月 日