自身免疫病患者外周血单个核细胞中miR34a和miR125b表达及临床意义（可编辑）

自身免疫病患者外周血单个核细胞中miR34a和miR125b表达及临床意义（可编辑） 自身免疫病患者外周血单个核细胞中miR34a和 miR125b表达及临床意义 分类号 ,?窆兰:2 密级一 垒珏 UDC 616 ?__?__????????__-__‘-__oi_?___??????__???-?_??_?一 编号_!鳇窆筵!Q!垒Q!L一 @江薛大擎 硕士学位 ?,STER’SDISSERTATIoN 论文目自身鱼痊痘蛊鲞生E圃鱼望仝核细胞生堡i&圣垒垒 塑堡iB:12?坠的麦达拯!庖废意幺 学科专业 !晦瘗捡验趁逝堂 作者姓名 迕枣玲 指导教师 邳启碰教授 兰生鱼且星日 答辩日期 2Q! 分类号 B5鲣:2 密级一 公珏 tiDe ?!亘 编号一!Q2窆 窆圣!Q!垒Q!l 自身鱼瘗痘皇鲞垒E周鱼望仝核绁胞主 堡iB:圣垒垒塑坐i基:兰2?坠的麦达拯!逝废意竖 andclinical ofmiR-34aand Expression significance miR-125bin bloodmononuclearcells peripheral PBMCs inwithautoimmunedisease patients 作者姓名: 许惠玲 指导教师: 邵启祥 教授 小组成员: 许化溪 教授 夏 圣 副教授 成静 高级实验师 申请学位: 硕士 学科专业: 临床检验诊断学 日’ 论文提交同期: 2013年4月27 论文答辩日期: 2013年6月8日 学位授予单位: 江苏大学 学位授予同期: 2013年6月 答辩委员会主席:吕力为 教授 评阅人: 独创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名: 年 月 日 学位论文版权使用授权书 江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊 光 盘版 电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致， 允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入 中国 学位论文全文数据库》并向社会提供查询，授权中国学术期刊 光盘版 电子杂 志社将本论文编入 中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提供查询。 论文的公布 包括刊登 授权江苏大学研究生院办理。 本学位论文属于不保密口。 学位论文作者签名: 指导教师签名: 年 月 日 年 月 日 江苏大学硕士学位论文 摘要 研究背景:自身免疫性疾病 autoimmunediseases，AID 是由于正常免疫 自稳失衡，机体免疫系统 免疫组织或和免疫器官 对自身组织成分产生免疫应 答而导致自身器官功能障碍和组织损害所引起的疾病。免疫系统在健康个体发挥 着维持机体免疫生理稳态的作用，一旦免疫系统对机体内自身抗原发生正性应答， 将造成免疫组织或免疫器官的病理性损伤，进而影响到机体的免疫生理稳态，最 终可能导致各种临床症状。AID发生机制较为复杂，有研究表明细胞凋亡异常与 其密切相关，有效促进T细胞凋亡是维持机体免疫稳态，纠正自身免疫反应 的一 个重要因素【ll。自身免疫性疾病主要包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、I型糖 尿病、桥本氏甲状腺炎、重症肌无力等一系列免疫性疾病。 单链非编码小RNA分子，广泛存在于多细胞生物体内，主要通过核酸序列互补匹 配结合到特定的靶mRNA上，抑制靶mRNA翻译过程或降解靶mRNA，主要起 到负向调控作用。大量的研究证实miRNAs参与机体的发生、发育等多种生物学 进程，部分miRNAs异常表达导致临床疾病，包括自身免疫反应。miRNA参与调 节机体各个免疫过程，已是一个不争的事实，有可能成为多种疾病诊断的生物学 巨噬细胞的发育、分化、活化、增殖和稳态的维持等生物学过程。而自身免疫性 cells，APCs 活化和抗原提呈， 以 疾病均存在着抗原提呈细胞 antigenpresenting 及T和B细胞的活化、增殖、分化等过程，因此我们推测两种miRNA可能参与 自身免疫病的发病过程。本研究选择了系统性红斑性狼疮和类风湿关节炎患者作 为研究对象，探讨miR(34a和miR(125b及其上、下游相关基因与自身免疫性疾病 的相关关系，为进一步阐明其与自身免疫病的发生、发展机制奠定基础。 第一部分类风湿关节炎患者PBMCs中 miR-34a和miR(125b的表达及临床意义 目的:本研究主要探讨RA患者PBMCs中miR(34a和miR(125b的表达水 自身免疫病患者外周血PBMCs中miR-34a、miR-125b的表达水平及临床意义 ,Thl7平衡入手，检测Foxp3和平并与其临床指标进行相关分析;从Treg RORTt 的表达水平，研究类风湿关节炎患者的免疫应答特征，以期阐明miRNA与Th细 能的机制。 方法:35例RA患者及39名健康对照人群，用实时荧光定量RT-PCR分析 的相关性及与病情活动的相关性。 结果: 伊 D酊 :而 2、RA患者blimp-1、IRF-4、ROR^rt和P53均高于健康对照组， 伊 玖笏 ; Foxp3与健康对照组相比，表达水平下调， IRF-4、RORyt和P53的表达水平均呈负相关， D(? :而与Foxp3无显著 伊 相 关( P 9(05 ; 4、miR-34a和miR(125b均与类风湿因子 1心 呈显著负相关，伊均 n?夕; 但与血沉 ESR 和抗CCP抗体不相关，伦n? ;miR(125b的水平与其相应 的CRP和ESR呈显著正相关，伊均 玖盼夕;但与ASO和抗CCP抗体无显著 相关，伶现? ; IRF-4、RORyt和P53的表达水平均高于健康对照组，而Foxp3贝lJ异常低 表达。 第二部分SLE患者miR-34a和miR(125b n 江苏大学硕士学位论文 的表达及临床意义 地了解SLE的发病机制提供一定的思路和线索。 Foxp3和P53的表达水平，分析miR-34a、miR(125b与病情活动的相关性。 结果i 的表达水平低于健康对照组， 伊 a?夕; 照组， 伊 D(? :而IRF-4的表达水平高于健康对照组，伊 D(仍 ; 而miR(34a的表达水平与C4不相关，协D(? ; 结论:SLE患者miR(34a的表达水平上调，而miR(125b的表达水平 下调， 目的:本研究主要探讨正常入单核细胞、non-T细胞、CD3+CD4+T细胞、 CD3+CD4"T细胞活化前后miR(34a和miR(125b的表达水平改变。 方法: l、密度梯度离心分离正常人的外周血单个核细胞，贴壁半个小时，分 离出单 Ill -34a、miR-125b的表达水 自身免疫病患者外周血PBMCs中miR 平及临床意义 核细胞，磁珠分离CD3+T、CD4+T细胞。 细胞与CD3+CIMT细胞用单抗CD3，CD28活化。 3、流式细胞仪检测分离出来的CD3+T细胞的纯度。 CD3+CD4"T细胞中miR-34a和miR(125b的表达水平 的表达水平下调。 关键词:CD3+CD4+T细胞，miR(34a，miR0125b 江苏大学硕士学位论文 ABSTRACT characterizedthe of Autoimmune are diseases，which by production thatreactwithhost areduetonormalimmune antibodies tissues， homeostasis characterizedthe of imbalance，whichby production human immune antibodiesthatreactwithhosttissues(Innormal body,the arolein the balance(Ifit physiological systemplays maintainingbody's to willresultin or responsesself-antigens，it immune their function organspathologicaldamage，affectphysiological and causea ofclinical mechanismof eventuallyvariety symptoms(The AID evidencesindicatedthatautoimmune iscomplicated(Increasing diseasesareclosetotheabnormal apoptosis(Whereaspromotingapoptosis and of is tomaintainimmunehomeostasis Tcells effectivelyimportant correctautoimmune diseases include mainly response(Autoimmune (rheumatoid 1 diabetes arthritis，systemicerythematosus，type lupus andotherseriesof mellitus，Hashimoto’Sthyroiditis，myastheniagravis diseases( autoimmune 21―25nucleotide RNA MiRNAs MicroRNAs areendogenous non―coding moleculesthatare inthemulti-cellularand widelypresented organisms are moleculesthatinhibitittranslationor viruses(They regulator negative toa mRNA(Anumberofresearches degradebybindingspecifictarget thatmiRNAsinvolveinhuman and haveconfirmed growthdevelopment anda of abnormal ofthem varietybiologicalprocesses，someexpressions V 自身免疫病患者外周血PBMCs中m诚-34a、miR-125b的表达水 平及临床意义 shownmiRNAs caninduceautoimmune studieshave that response(Recent and thefunctionsofboththeinnatethe 101DOUBe regulate adaptive system, areinvolvedinvariousimmune could serveas pathways，andpotentially diseasebiomarkersand studieshaveshownthat therapeutictargets(Recent miR一34aandmiR-1 rolesinthedi 25b important fferentiation， play and homeostasisother of activation，proliferation，andbiologicalprocesses T cells，B cellsand ateactivationsof macrophages(There cells,ArCs and antigen―presentingcells antigenprecenting antigen as wellasthe presentations process ofTandBcellsinautoimmune thattwo disease,(Therefore，we speculated miRNAsbeinvolvedinthe ofautoimmunediseases， In may pathogenesis to miR一34aandmiR一1 this aimed 25b profiles study，we explore expression the the andmiR-??1 in and of associatedmiR??-34a 25b potentialtargetgenes the and of and pathogenesisdevelopmentsystemiclupuserythematosus rheumatoid toset thefoundmionformechanismofthe arthritis，and up occurrenceand ofautoimmunediseases( development PartI andclinicalficanceofmiR一34aand Expression signi miR??r125bin bloodmononuclearcells peripheral PBMCs inPatientswith arthritis rheumatoid to aimed miR―??34aandmiR-??125b Objective:Thisstudy explore inPBMCsfrom withrheumatoidarthritisand expressionprofiles patients Vl 江苏大学硕士学位论文 the oftheassociatedmiR-34aandmiR-125binthe targetgenes ofrheumatoidarthritis(Westartwith l7 the balance pathogenesis Treg,Th and theimmune inrheumatoidin study responses arthritisorderto clarify thecharacteristicsofimbalanceoftheThcells function subtypes andthe miRNA( Methods:Bloodwerecollectedfrom35 with samples patients rheumatoidarthritisand39normal chain persons(Real―timepolymerase reaction PCR wasusedtomeasurethe levelsofmiR-34aand expression miR一125binPBMCsfromrheumatoidarthritisandnormal persons(Then wemeasured the levelsof and expression the betweenthe of (Furtheranalysisrelationship expression Foxp3 25bandclinicalfeaturefromrheumatoidarthritis miR??34a，miR一1 patients( Results:1(Real-timechainreactionresultsrevealedthat polymerase thelevelsofmiR????34aandmiR????125bwere in lowerPBMCs significantly fromrheumatoidarthritisthannormalcontrols( 2(The of and inrheumatoid expressionblimp一1，IRF-4，P53ROR丫t arthritiswere thanthatin significantlyhigher generalpopulation，while lower wasobservedthannormalcontrols( Foxp3 3(Further showedthatthe ofmiR一34aand analysis expression miR一1 correlatedwith and 25b，werenegatively blimp一1，IRF-4，P53RORyt， whiletherewasobserved nocorrelationbetweenmiR一125band Foxp3( V? 自身免疫病患者外周血PBMCs中miR-34a、mJR-125b的表达水平 及临床意义 The levelsofmiR-34awas correlated丽tll expression positively Foxp3( 4(Wealsoconfirmedtllatthe levelsofmiR-34aand expression miR-1 levelsof 25b，were correlated诵也RF;The negatively expression miR-34aWas and correlated谢也CRP thereWas significantly ASO，while 34aand Wasalsono nocorrelationbetweenmiR- ESR,anti―CCP(There correlationbetweenmiR-125band ASO，anti-CCP(But positive correlationbetweenmiR-125band CRP，ESR( Conclusions:ThecurrentdiscoveredthatthelevelsofmiR一34a study andmiR一125bwere lowerin bloodmononuclear significantly peripheral cellsfromrheumatoidarthritisthannormal of and in ROR丫trheumatoidarthritiswere expressionblimp-1，IRF-4，P53 thanthatin Wasobserved significantlyhigher generalgroups，whileFoxp3 lowerthannormalcontrols(ThesedataidentifiedmiR(34aandmiR(125b roles theonsotofrheumatoidarthritis( playimportantduring KEYWORDS: rheumatoid miR一1 arthritis，miR-34a，25b， blimp一1，IRF-4，RORyt，Foxp3 PartII andclinical ofmiR????34aand Expression significance miR-125bin bloodmononuclearcells peripheral PBMCs inPatientswith systemiclupuserythematosus VIII 江苏大学硕士学位论文 aimedto miR-34aandmiR-125b Objective:Thisstudy investigate blood mononuclearcellsfrom expressionprofilesin刚pheral patients with andthe ofthe systemiclupuserythematosuspotentialtargetgenes associatedmiR一34aandmiR-125binthe of pathogenesissystemiclupus erythematosus( Methods:Bloodwerecollectedfrom23 with samples patients 30 PCRwasusedto andnormalcontrols( erythematosus systemiclupus measurethe levelsof expressionmiR-34a，miR-1 and in from PBMCs23 and30normal RORytFoxp3 patients persons( Results: 1(Real―time chainreaction polymerase resultsrevealedthatthelevels ofmiR一34awere in bloodmononuclearcells significantlyhigherperipheral from thannormal miR一1 25b systemiclupuserythematosuspersons，while wasobservedlowerthannormalcontrols( 2(The of and in expressionblimp??1，P53，RORytFoxp3systemic were lowerthanthatin lupuserythematosussignificantly general IRF-4wasobservedthannormal population，while higher controls( that 3(Further showedthe levelsofmiR一 34aand analysis expression miR-1 correlatedwith and 25b，were RF，ESR，CRPASO，while positive therewasobservednocorrelationbetweenmiR-34aandC4(The levelsofmiR??125bwas correlatedwithC4( expression significantly IX 自身免疫病患者外周血PBMCs中miR-34a、miR-125b的表达水平 及临床意义 Conclusions:ThecurrentdiscoveredthatmiR-34awas study up―regulated inSLEWhilemiR-125bwas of down-regulated(Moreover,the expression and in were blimp-1，P5，RORTtFoxp3systemiclupuserythematosus lowerthanthatin IRF-4 was significantly generalpopulation，while observedthannormalcontrols( higher KEY 25b， WORDS:systemiclupuserythematosus，miR-34a，miR一1 blimp一1，IRF-4，RORTt，Foxp3 Part1II 25b immune miR-34a，miR-1expression(insystem 25b inthe Objective:ToinvestigatemiR一34a，miR一1 expression beforeandafter ofMononuclear activation cells，non(Tcells，CD3+CD4+T andCD3+CD4Tcellsinnormal persons( Methods: 1(PBMCswereisolatedfromthe venousbloodof peripheral healthy donors centri were cells isolated bydensitygradientfugation(Mononuclear fromPBMCsadherentcultureforhalfanhour(CD3+TandCD4+Tcells by wereisolated and microbeads bythe using protocolsprovided manufacturer( 2(Mononuclcarcellsandnon―Tcellswereactivated200 by ng,ml LPS。CD3+CDCTcellsandCD3+CD4-Tcellswereactivated bYsingle- antiCD3andCD28( X 江苏大学硕士学位论文 3(Flow wasusedtodetectthe of cytometry CD3+Tcells( purity 4(Altered 25bwereconfirmed miR-34a，miR-1 Real― timePCRin by Mononuclear cellsand cells，Non(T CD3+CD4Tcells( cells，CD3+CD4+T Results:The ofmiR-34abe expression maysignificantlyup―regulated inactiveMononuclear and cells，non(T CD3+CD4Tcells(Theactivationof Mononuclear cellsand cells，non-T CD3+CD4+T cellshad levelsofmiR-1 higher 25b significantly expression( Howeverthe ofmiR一125bwaslowerinCD3+CD4"T expression cells( Conclusions:The ofmiR-34aandmiR-1 expression 25bwere inactiveMononuclear cellsand significantlyup-regulated cells，Non(T CD3+CD4+Tcells(MiR(34awas whilemiR(125bWas up―regulated inthe activationofCD3+CD4"Tcells( down―regulated KEY WORDS:CD3+CD4+T 25b cells，miR(34a，miR(1 XI 自身免疫病患者外周血PBMCs中miR-34a、miR-125b的表达水平及临床意义 目录 第一章绪论 1 1(1类风湿关节炎研究进 展…………………………………………………………l 1(1(1 类风湿关节炎的临床概述………………………………………………(1 1(1(2类风湿关节炎的发病机制………………………………………………((1 1(1(3 Treg,Thl7与类风湿关节炎………………………………………………2 1(2系统性红斑狼疮研究进 展…………………………………………………………2 1(2(1 SLE的临床概述…………………………………………………………(2 1(2(2 SLE的发病机制…………………………………………………………。3 1(2(3 7与 SLE……………………………………………………………………………4 Treg,Thl 1(3miRNA与自身免疫 病…………………………………………………………。4 1(3(1微小RNA概述……………………………………………………………(4 1(3(2 miR(34a和miR(125b…………………………………………………………………………5 1(4 Blimp-1和IRF-4………………………………(……(……………………………………………(6 1(4(1 Blimp-1概j丕……………………………………………………………………………………(6 1(4(2 IRF-4概j丕………………………………………………………………………………………((7 第二章研究目的、方法、实验设计和意义 2(1研究目 的…………………………………………………………………………(9 2(2研究方 法…………………………………………………………………………9 2(3实验设计方 案…………………………………………………………………(1l 2(4研究意 义…………………………………………………………………………12 3(1材料与仪 器………………………………………………………………………13 3(1(1试剂………………………………………………………………………………………………(13 3(1(2主要溶液的配 制…………………………………………………………((14 3(1(3主要仪器耗 材……………………………………………………………一14 3(2方 法………………………………………………………………………………………………………l5 3(2(1总RNA的提取和Real(timePCR分析…………………………………(15 3(2(3流式细胞仪检 测…………………………………………………………一24 X? 江苏大学硕士学位论文 3(2(4主要统计学分 析…………………………………………………………………24 3(3结果……………………………………………………………………………………… ………………24 3(3(1 …………………(………………………………………………………… …(…………(……………(……:!―l 3(3(2 ………(……………………………………………………………(……(……………………………(……:I:1 第四章结论和展望 39 4(1结论………………………………………………………………………………………………………39 4(2展望………………………………………………………………………………………………………39 参考文献 致谢 45 XIII -34s、miR-125b的表达水 自身免疫病患者纤局血PBMCs中miR 平及桩床意义 英文缩略语表 缩略语 英文名称 中文名称 miRNA microRNA 微小RNA mRHA ribonucleicacid message 信使核糖核 酸 bp basepair 碱基对 p-actin Bcta-actin D肌动蛋 白 RT 椰e 反转录 transcription PCR chainreaction 聚合酶链反 应 polymer'ase MACS cell 免疫磁珠细胞分选 magnetic sorting ddH20 doubledistilled H20 双蒸水 FCM Flow Cytometry 流式细胞 术 PE Phyco枷 藻红蛋白 OD OpticaldensiW 吸光度 PBS saline Phosphate-buffer 磷酸盐缓冲液 rpm roundsminute 每分锋转速 per LPS 脂多糖 lipopolysaeeharide DEPC diethylpyrocarbona拇 二乙酯焦碳酸 eDNA DNA 互补DNA complementary FBS fetalbovine$,Y11111 胎牛盘 清 EB e心tidiumbromide 溴化乙 锭 CS calfserum 小牛盘清 XIV 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 1(1类风湿关节炎研究进展 1(1(1类风湿关节炎的临床概述 类风湿关节炎 rheumatoidarthritis，l认 是以对称性多关节病变为 主要表 现的慢性、致畸性、系统性自身免疫性疾病，致残率高，人称不死的“癌症 "， 其发病缓慢，病程冗长，反复发作，难以彻底根治。RA呈全球分布，全世界的 发病率平均为1,，在我国的发病率为0(26,加(5,，男女比例为1:3，可发生于 任何年龄，发病的高峰为45--'50岁。RA是主要的致残性疾病之一，约一半的病 人在2年内可发生关节破坏，大多数患者出现程度不等的功能受损和关节畸形。 RA是造成我国人群丧失劳动力和致残的主要疾病之一，给社会和家庭带来巨大 的压力和负担。其病因及发病机制仍未明确，治疗效果也难尽人意。因此目前临 床上尚缺乏根治及预防本病的有效措施。因RA的治疗需要长期用药，故需要评 估RA疾病活动性的敏感指标，以指导治疗方案的调整。 1(1(2类风湿关节炎的发病机制 RA是一种抗原驱动、T细胞介导的系统性、自身免疫性疾病。免疫反应的 产生是由于机体免疫调节和淋巴细胞亚群间的相互作用失调引起的细胞免 疫功 能低下，体液免疫增高，造成免疫功能紊乱。RA的发病机制比较复杂，其中有 多种免疫细胞的参与。大量的临床和基础研究表明T细胞参与了RA中免疫应答 的诱导和发病【2，3l。RA的免疫学异常包括T细胞亚群失调和T细胞的异常活化， 胞活化并增殖，继而巨噬细胞和B细胞等被激活，激活的B细胞可以产生类风 citrullinated 湿因子 RF 和抗环瓜氨酸肽抗体 Anti(cyclicpeptide，anti(CCP 。 最近，有研究表明miRNA参与T、B淋巴细胞的分化，参与固有免疫应答和 适 应性免疫应答，可能在自身免疫性疾病如RA中发挥重要作用【4'5】。本课题通过 检测分析miR(34a及miR(125b在RA患者外周血的表达水平及与疾病活动程度、 临床指标的关系，有助于进一步探讨其在RA发病及疾病进展中的意义。 自身免疫病患者外周血PBMCs中miR-34a、miR-125b的表达水平及临床意义 1(1(3Treg,Thl7与类风湿关节炎 Thl7细胞是近年来发现的一类不同于Thl、Th2的CD4*T淋巴细胞新亚群， 主要通过分泌IL-17A等细胞因子发挥促炎作用，介导胞外病原菌感染的炎性反 应、自身免疫性疾病、慢性炎症性疾病及肿瘤和移植排斥等的发生和发展，是引 起组织损伤主要的细胞。在人类RORyt为Thl7细胞分化生长的关键转录因 子【2】。 调节性T细胞 Treg 是一类在维持自身免疫耐受及阻止自身免疫反应的发 生中具有重要作用的11l细胞亚群，它主要通过细胞接触依赖机制【7??8】或分泌细胞 受的重要组成部分，能够抑制CD4*r、CD8+T细胞的活化和增殖。研究证实， box 转录因子Foxp3 forkheadp3 特异性表达于调节性T细胞，与调节性T细 胞的生长发育和功能维持密切相关【II’121。Treg细胞功能的异常可导致肿瘤和自 身免疫性疾病的发生【13-i5(J。 Thl7、Treg细胞均来源于初始T淋巴细胞，其功能和分化过程相互拮抗。 正常情况下两者保持相对平衡，Treg,Thl7平衡有利于机体免疫稳定状态的维持。 既往研究发现，Treg,Thl7细胞比率失衡存在于类风湿性关节炎、原发性肾病综 合症和SLE等多种慢性炎症性疾病中，提示Treg,Thl7失衡可能是慢性炎 症性疾 病的特征性病理改变，在其发病机制中发挥重要作用【幡191。那么，Treg,Thl7失 衡是否受miRNA调控昵?它与miRNA在这些疾中的作用又有何联系呢? 本研究应用荧光定量PCR技术检测类风湿关节炎患者外周血Treg,Thl7的 转录因子Foxp3、RORyt的表达水平，进一步分析类风湿关节炎患者体内 sedimentation erythrocyte 细胞亚型功能失衡的特征，探讨miRNA在类风湿关节炎中的作用及其可能的机 制。本实验将为RA发病机制的研究开辟新的途径，提供新的研究靶点，完善 RA发病机制中的1nh细胞失衡理论，为其防治策略的建立寻找到新的突破口。 (2系统性红斑狼疮研究进展 1 1(2(1 SLE的临床概述 系统性红斑狼疮 Systemiclupus 2 江苏大学硕士学位论文 多器官的复杂的慢性的严重危害人类健康的自身免疫性疾病，其主要特征是患者 T细胞过度激活，辅助自身B细胞产生多种针对其自身抗原的自身抗体，通过免 疫复合物等途径造成体内多器官的炎症反和组织损伤。临床表现为面部红斑、关 节疼痛、发热、白细胞下降、血尿、蛋白尿等。近几十年来，SLE的发病率和致 残率有上升趋势，以至于呈现出一个全球性的健康问题，据统计全球每10万个 --100人发病，并且男女差异显著，比例约为l:似，在我国人当中就有10 每10 万个人当中就有约70人患这种疾病。 目前临床上治疗红斑狼疮最常用的措施是使用非特异性免疫抑制剂、细胞毒 药物和激素等。虽然这些药物可以有效地抑制免疫活性细胞，控制疾病的发展， 但副作用大【31，另一方面由于用药后自身反应性淋巴细胞持续存在，因此很难达 到治愈的目的【4】。近年来针对分化为浆细胞产生抗体的B淋巴细胞治疗红斑狼疮 虽然取得了一些进展【卯，但还不能有效清除浆细胞，体内长寿浆细胞依然分泌自 身抗体，这些抗体可再次激活病理性免疫应答反应，进而导致SLE患者复发， 所以寻求针对分泌抗体的浆细胞的新靶已标成为核心问题。 1(2(2 SLE的发病机制 SLE是一种全身多系统受累的慢性进行性、反复发作和缓解的自身免疫性疾 病，其发生发展涉及复杂的免疫机理。现普遍认为免疫调节和免疫细胞功能异常 在SLE的发病中起主导作用【6】，其中淋巴细胞亚群失衡及其异常凋亡与SLE的 发生发展密切相关【24,25】。目前导致SLE的发生、发展的分子机制尚未十分明确， 但近年来的研究表明，除了遗传因素、性激素和环境因素等的相互作用引起的免 疫系统调节功能紊乱外，表观遗传机制miRNAs在SLE的发生发展中起着至关 重要的作用。目前已有多项研究证实，由人体免疫细胞表达的miRNAs可以影响 固有免疫和适应性免疫系统中的多个分子通路，并且在细胞增殖、分化、调亡和 细胞因子反应等多个方面起到调节作用。而且，miRNAs在自身免疫性疾病T细 著下调，提示miRNAs影响CD4+T细胞过度活化在SLE发病过程中有重要意义。 有研究发现miR(126对于SLECD4+T细胞甲基化具有调控作用，推测其余众多 的miRNAs也可能与miR(126类似，参与SLE发生和发展。 3 自身免疫病患者外周血PBMC(s中miR-34a、miR-125b的表达水平及临床意义 SLE是世界范围内常见的非器官特异性自身免疫性疾病，其发病与多克隆的 B细胞激活和自身反应性T细胞有关。近来研究认为T细胞及其亚群可能是SLE 免疫发病机制的关键。而T细胞亚群中的Treg,Thl7的相互制约及平衡对机体免 Thl7通过分泌不同的细胞因子，相互疫应答具有重要的调节作用。Treg, 调节， 反向抑制，在免疫网络中发挥不同的生物学功能。一旦二者之间的平衡被破坏， 就会导致病理状态，来自动物模型与人类疾病的证据表明，自身免疫病存在 胞过度浆化，产生多种自身抗体，导致病理损伤。最近又有研究提示CD4+Foxp3+T 究结果并不一致，其作用和作用机制值得进一步探讨。越来越多的证据表明Treg 在维持免疫耐受、防止自身免疫病的发生等多方面发挥重要的作用，所以我们通 ? ? 过检测外周血中Treg,Thl7转录因子的变化，探讨其在SLE发病中的作用。 1(3 miRNA与自身免疫病 1(3(1微小RNA概述 1---25 个核苷酸组成的内源性单链非编码小RNA分子。miRNAs最早于1993年在线虫 中被Lee等观察到，2005年之后逐步成为表观遗传学范畴的研究热点，是近年 来医学和细胞生物学史上的主要突破之 [29-3?。miRNA是通过与靶mRNA 3'UTR untranslated 进行切割和降解或者翻译抑制。miRNA与靶mRNA之间的匹配程度决定了 类似于siRNA的作用机制导致靶mRNA切割和降解，相反，在动物中大部分 而下调靶基因的表达【32’331。miRNA绝大部分定位于基因间隔区，其转录独立于 其他基因，并不翻译成蛋白质。miRNA的主要功能是进行转录后调控 post transcriptional 基化或扩增都很容易引起miRNA的激活或失活。而miRNA的异常表达则可能 4 江苏大学硕士学位论文 导致其相应靶基因的异常，如miRNA活性丧失使靶基因过表达，而miRNA激 活则会导致靶基因下调，这些过程可能参与细胞增殖、凋亡和血管发生等过程。 目前认为包括人类和哺乳动物在内的大部分真核生物的基因组都编码数百 种miRNA，而miRNA的表达水平在不同组织和不同发育阶段具有显著差异。 miRNA直接调控基因组中30,以上的人类蛋白编码基因，在某类型的细胞中任 何一个miRNA的靶基因一般不会只有一个，而每一个靶基因又可能和多个 miRNA相互作用，组成了错综复杂的调控网络，在转录后水平对各种基因进行 复杂的调控。现已有多项研究证实miRNAs能够影响机体内环境的稳定、肿瘤的 发生、对环境的适应性、宿主细胞和外界病原体之间的相互作用等一系列生物学 进程，是生物体自身的一套正常的调控机制，对生长发育有重要作用，同时参与 细胞凋亡、增殖、分化、代谢和迁移等多种生命过程。越来越多的证据表明， miRNA表达异常与自身免疫性疾病【34，351、肿瘤【36―71、心血管疾矧71、病毒感染 【39J和神经退行性疾病?4I】等多种疾病的发生