湘西虎杖抑菌成分提取及其抑菌活性研究初报

湘西虎杖抑菌成分提取及其抑菌活性研究初报 湘西虎杖抑菌成分提取及其抑菌活性研究 初报 第2期(总第75期) 2005年4月 中国林副特产 ForestBy—ProductandSpecialityinChina No.2(GSNO.75) Apr.2005 湘西虎杖抑菌成分提取及其抑菌活性研究初报 卢成瑛,黄早成,李翔,钟维 (吉首大学湖南省林产化工工程重点实验室,湖南张家界427000) 摘要:以乙醇作溶剂,对湘西虎杖抑茵活性物提取条件进行研究,通过抑茵实验得到最佳提取条件为 A.B2C3,即9O乙醇,6O?,3h,该条件下的提取物对细茵生长的抑制活性最强,但对酵母茵无明显的效果,对 三种受试细茵的最小抑茵浓度(MIC)为0.25,0.5g/ml.提取物经85?,100?,15min或pH2~8处理后仍 具有较强的抑茵活性,其乙酸乙酯萃取物对三个茵都有较强的抑茵活性. 关键词:湘西;虎杖;提取物;抑茵活性 Preliminarystudy0ftheextraction0fthebacteriarestraining elementstromPolyonunesCUSpidatumandthe relatedrestrainingactivity LuChengying,HuangZaocheng,LiXiang,ZhongWei (TheKeyLaboratoryForForestProductsChemicalIndustry EngineeringofHunan,JiShouUniversity,Zhan舀iajie,Hunan,427000) Abstract:Thistestadoptedtheethanolasthesolvent.Theconditionsforextractingantimicrob ial substancefromthePolygonumCU5pidatumhavebeenresearched.Theoptimumextracting condi— tioniS90ethanol,60?,3h.Theresultsshowedthatthesubstancecouldeffectivelyinhibitthe growthofbacteria.yetnotSOmuchtOyeast.Theminimalinhibitionconcentrationswereabo ut 0.25,O.5g/mlagainstthethreebacteria,theacid— baseandheatstabilitywasgood.Theextract ofateticesterhadtheremarkablebacteriostasisagainstthethreebacteria. Keywords:theWesternofHunan;Polygonunescuspidatum;extract;bacteriostaticactivity 虎杖(PolygonunescuspidaturnSieb.etZucc.)为蓼科 蓼属多年生草本植物,分布于我国中南部地区,其性味微 苦,微寒,归肝,胆,肺经,具活血散瘀定痛,清热解毒利湿, 化痰止咳通喘之功效].中医临床上应用于风湿,筋骨疼 痛,湿热黄疸,淋浊带下,妇女经闭,产后恶露不下,疮漏 下血,跌打损伤,烫伤,恶疮癣疾等疾病的治疗.近年来, 国内外对虎杖的化学成分与其化学成分的提取分离做了较 多研究,已从中分离到蒽醌类,二苯乙烯类,萘醌类,黄酮 类等化学成分,现代药理研究证实虎杖有显着的防腐,抗 菌,抗病毒,抗炎,抗癌,抗心血管疾病等活性].虎杖在湘 西地区广有分布,蕴藏量较大,明确湘西虎杖的药理作用是 对湘西虎杖这一重要资源进行有效的综合开发利用的重要 保证,但目前对虎杖抗菌抗病毒,清热解毒药理作用的研究 由于提取工艺的不同及判定不同导致有的结果相互矛 盾,尚缺乏系统及深入研究.为此我们从研究虎杖抑菌活 性入手,结合抑菌实验寻找最优的提取抑菌物质的方法,了 解温度,pH值对其抗菌活性的影响,为虎杖在天然食物抗 菌防腐,动植物疫病防治等方面的开发应用提供参考. 1材料与方法 1.1试验材料 虎杖粉:虎杖根,茎2003年10月采自湖南省桑植县 八大公山,晾干,粉碎备用. 1)基金项目:湖南省自然科学基金项目(O3JJY6O16) 收稿日期:2004一O8—18 供试菌种:金黄色葡萄球菌(&口zo?cz"s aureu$),大肠杆菌(Escheichiacoli),痢疾杆菌 (Shigelladysenteroae),酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)购于湖南省疾病预防控制中心,冷冻保藏. 培养基:牛肉膏蛋白胨培养基(固液两种),沙氏培养基. 仪器:薄膜旋转蒸发仪(RE540yamato),pH酸度计 (HM?205TOA),培养箱(PW/10?002重庆实验设备厂), 超净工作台(CCV?1311),高压蒸汽灭菌器(SM?52),i/万 天平(AEG-22O). 1.2虎杖抑茵成分的提取 用乙醇作提取溶剂,以溶剂浓度A,提取温度B,提取 采用L呻(3.)正交正交实验. 时问C三因素三水平, 取虎杖粉加入适量溶剂回流提取,趁热过滤,滤液减压浓 缩至含生药浓度1g/ml,检测各提取物对金黄色葡萄球 菌,大肠杆菌,痢疾杆菌,酵母菌生长的抑制活性,经方差 得最佳提取条件. 表1虎杖抑菌活性物提取因素水平表 1 2005血中国林副特产第2期 1.3K—B纸片扩散法测定抑茵活性 在盛有2O片6ram无菌滤纸片的安培中加入0.2 ml提取液,45?烘干备用.将试验菌种接于试管斜面, 37?,24h下培养,重复两次活化菌种,向菌种管中加入适 量生理盐水,将菌苔刮下混匀,麦氏比浊配成10.cfu/ml 的菌悬液备用.在超净工作台上向培养皿平板中分别加 入0.1ml菌悬液,L型玻棒涂布均匀,将药敏纸片等距放 入含菌平板,细菌在37?培养12h,真菌在28?培养24h 后开始观测记录结果.另设蒸馏水,乙醇及1mg/ml黄连 素作对照. 1.4最小抑茵浓度(MIC)测定 将在6O?,3h条件下的虎杖9O乙醇提取物用6O 乙醇溶解,稀释成不同浓度,取药液0.1ml加入到装有 0.8ml的牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中,接入0.1ml 的菌悬液,充分摇匀,使各试管的茵液浓度为107efu/ml, 含生药量分别为1,0.75,0.5,0.25,0.1,0.075,0.05g/ ml,37?,12h,从各试管中取出培养液0.1ml,分别涂布平 板,37?,12h,观察有无菌生长.另设含等体积6O乙醇 作阴性对照,不加乙醇和药液的培养管作空白对照及1 mg/ml黄连素作阳性对照. 1.5酸碱稳定性试验【6] 用0.1mol/mlHCI和0.1mol/mlNH3溶液将在 6O?,3h的9O乙醇提取液pH值分别调至2,4,5,6,7, 8,9,10,12,保持药液浓度为1g/ml,K—B纸片法测定抑菌 效果. 1.6热稳定性试验][7] 试管分装6O?,3h条件下9O乙醇提取物,置不同 温度处理后用K—B纸片法测定抑菌效果. 1.7抑茵活性物的初步分离 将在6O?,3h的9O乙醇提取液依次用石油醚,乙 醚,乙酸乙酯,正丁醇萃取,各萃取液及萃余水相适量浓缩 至药液浓度为lg/ml,采用K—B纸片法测定抑菌效果. 2结果及分析 2.1虎杖抑茵成分的提取 表2为正交试验各提取物对三个受试细菌的抑菌结 果,因各提取物对酵母菌生长无抑制作用,故未列入统计 表.虎杖乙醇提取物对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,痢疾 杆菌生长有较好的抑制作用,但提取温度达75?,1h时对 大肠杆菌的抑制作用消失.直观数据分析表明R2>R1 >R3,即因素B(提取温度)的影响最大,因素A(溶剂浓 度)次之,因素C(提取时间)影响最小,最佳条件为 A.G,即9O乙醇,6O?,3b.方差分析结果表明因素 A,B影响显着,均方离差可见因素影响的主次顺序仍然是 B,A,C. 表2正交试验结果分析表 试验因素 ABC S.aE.cS.dTt mlj mzj m3j Rj 113 210 311 212 313 110 313 ll3 21 117 119 130 39.00 39.67 43.33 4.33 9 1O - 18 21 - 21 22 14 15 14 17 18 15 19 2l 21 36 35 25 47 52 25 53 56 37 表3正交试验方差分析表 2.2最小抑茵浓度(MIC)的测定 虎杖提取物对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌的最小抑菌浓度均为0.25g/ml,对痢疾杆菌的最小抑菌浓度为0.5g/ml. 表4虎杖提取物的最小抑茵浓度测定 注;"一"无菌生长,"+"菌体较少,"++"菌体较多. 2.3酸碱稳定性试验提取物在pH2~8时保持较强的抑菌活性,说明虎杖提取 酸碱处理对虎杖提取物抑菌活性有一定的影响,虎杖物酸碱稳定性较好.pH?9时,虎杖提取物对大肠杆菌, 2 37O7 63536O6 123123123333....1115798 4421 O377 ; 46O366 1l1222333nH色L&qu441 号一000.‰ 2005年卢成瑛等:湘西虎杖抑茵成分提取及其抑茵活性研究初报第2期 注:"一"表示无明显抑菌圈(下同). 2.4热稳定性试验菌活性影响不大,提取物经85T,100T,15min处理后仍具 热处理对虎杖提取物抑菌活性有不同程度的影响,其有较强的抑菌活性.但在75T,85T,100T,lh或121T, 中高温短时处理后提取物对金黄色葡萄球菌,痢疾杆菌抑15rain处理抑菌活性减弱,并对大肠杆菌失去抑菌活性. 表6热处理提取物的抑菌活性(抑菌圈直径:ram) 2.5抑茵活性物的初步分离 虎杖提取物经不同溶剂萃取后,其中乙醚萃取物对金 黄色葡萄球菌有抑菌活性,乙酸乙酯萃取物对三个菌都有 较强的抑菌活性,石油醚,正丁醇萃取物及萃余水相无抑 菌活性. 表7不同溶剂萃取物的抑菌活性(抑菌圈直径:mm) 3结语与讨论 以乙醇作溶剂,通过正交实验得到最佳提取条件为 9O乙醇,6O?,3h,该条件下的提取物对金黄色葡萄球 菌,大肠杆菌,痢疾杆菌生长的抑制效果明显,但对酵母菌 无明显的效果.提取温度和溶剂浓度对提取物的抑菌活 性影响显着,提示在虎杖抑茵成分提取时应注意控制乙醇 浓度和提取温度.虎杖乙醇提取物对细菌生长有较好的 抑制作用,但提取温度达75?,1h或提取物经85?, ]00?,lh,121?,15min处理抑菌活性减弱,对大肠杆菌 的抑制作用消失,提示虎杖中含有一类不耐高温的和一类 耐高温抑茵物质.. 最小抑菌浓度(MIC)测定表明,虎杖最佳提取条件下 提取物对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌的最小抑菌浓度均为 0.25g/ml,对痢疾杆菌的最小抑菌浓度为0.5g/ml. 虎杖提取物在pH2,8时保持较强的抑菌活性,说 明虎杖提取物酸碱稳定性较好.在pH?9时,虎杖提取 物对大肠杆菌,痢疾杆菌生长的抑制活性减弱,在pH一 12时丧失活性,但对金黄色葡萄球菌仍有抑制活性,提示 虎杖含有在pH12时失活的对革兰氏阴性菌有选择性抑 制活性物和在pill2时仍较稳定的对革兰氏阳性菌有选 择性抑制活性的化合物.虎杖提取物不同溶剂萃取分离 试验结果显示乙酸乙酯萃取物对三个菌都有较强的抑菌 活性,可为抑菌活性成分的进一步分离纯化提供参考. 湘西虎杖具很强的抑茵活性,可望用于食品保藏,抗 菌消炎诸多方面,我们拟深入研究湘西虎杖抑菌活性物质 的性质,结构及其在虎杖中的含量,为湘西虎杖资源综合 开发夯实基础. 参考文献 l中国药典.一部.2000.167. 2张喜云.虎杖的化学成分,药理作用与提取分离.天津药 学,1998,ll(3)13. 3吴新安,花日茂,岳永德等.植物源抗菌,杀菌活性物质研 究进展.安徽农业大学,2002,29(3):245~249. 4黄钰铃,王斌.山茱萸果实肉抑菌物质的提取及抑菌作用 的研究.食品科学,2004,25(5):40~43. 5叶磊.山楂核于馏油抑菌及杀菌作用的研究.北京联合大 学(自然科学版),2003,53(3):48~51. 6杨海燕,郭丽,傅力等.辣椒碱的抗菌作用.新疆农业大学 ,2002,25(4):63,66. 汪海峰,姚明兰等.银杏叶提取物抗菌特性研究. 7周建新, 食品科学,2002,23(9):l18,121. 8翟梅枝,李晓明,林奇英等.核桃叶抑菌成分的提取及抑 菌活性.西北林学院,2003,18(4):89,91. 作者简介:卢成瑛(1952一),女,土家族,教授,主要从事微 生物和植物资源开发利用方面的研究,发表论文2O余篇;E— mail:Icy2109@l63.com. 3