猪皮下和内脏脂肪组织microRNA转录组的鉴定与差异

猪皮下和内脏脂肪组织microRNA转录组的鉴定与差异 猪皮下和内脏脂肪组织microRNA转录组的鉴定与差异 猪皮下和内脏脂肪组织microRNA转录组的鉴定与差异 猪(Sus scrofa)在肉类产业中占有重要地位,随着高通量测序技术(Solexa sequencing)在miRNA测序中的广泛应用,利用niRNA-seq技术挖掘到大量与特定生物学或组织学功能相关的miRNAs。通过比较组织或生物学过程中miRNAs的表达差异,可以为解释脂肪组织中的成脂和脂肪细胞分化差异提供依据,同时,发掘与脂肪沉积调控相关的miRNA,为猪肉质改良提供后备基因。本文选取3头210日龄的健康长白母猪,测定了猪背部皮下上层脂肪(Upper layer of backfat, ULB)、背部皮下下层脂肪(Inner layer of backfat,ILB)、心脏包膜脂肪(Pericardial adipose, PAD)、腹膜后脂肪(Retroperitoneal adipose, RAD)、肠系膜脂肪(Mesenteric adipose, MAD)和大网膜脂肪(Greater omentum, GOM)的脂肪细胞体积及炎症相关基因的表达差异。采用Solexa测序方法分析了6个文库的miRNAs表达谱。利用IDEG 6.0等软件,分析了这6个脂肪组织中miRNA的表达差异。通过组织和基因的聚类分析,探讨6个脂肪组织中miRNAs的表达规律。利用靶基因预测软件MicroCosm,预测了高丰度差异niRNAs调控的靶基因。通过GO (Gene ontology)和Pathway分析,研究了这些靶基因参与的生物学过程,从而解释这些差异表达miRNA在不同部位脂肪组织中的生物学功能差异。荧光定量结果显示,巨噬细胞标志基因CD14在内脏脂肪中的表达量显著高于皮下脂肪组织(p0.05),说明在VATs中的巨噬细胞数量高于SATs。组织石蜡切片研究结果显示,长白母猪在210日龄时,SATs (Subcutaneous adipose tissues)的脂肪细胞体积极显著大于VATs (Visceral adipose tissues)(p0.01)。通过Solexa测序,在6个脂肪组织小RNA文库中共获得803条miRNAs,其中,199条miRNAs已在miRBase数据库中公布,新发现miRNAs604条。miRNAs表达种类分析结果显示,6个文库两两间的共表达基因数相似(326?9个)。SATs与VATs间的差异基因总数达到398个,这部分差异基因中,在VATs中特异性表达的有303个。共表达基因的聚类分析结果显示,2个SATs与4个VATs明显的聚为2类。共表达miRNAs表达量差异分 析显示,198个基因在、VATs与SATs间存在显著差异。与4个VATs miRNAs表达量比较,49个miRNAs在ULB中上调,81个出现下调;ILB中94个miRNAs出现上调,59个呈现下调。对SATs和VATs差异表达前10位的miRNAs做靶基因预测及GO和Pathway注释,结果显示,在SATs中上调的miRNAs调控的基因主要富集于能量代谢和脂肪代谢过程中,在VATs中上调的miRNAs主要参与炎症反应和免疫应答过程。通过本文的研究,不仅增加了猪脂肪组织中表达的候选miRNAs数量,还从miRNAs的角度初步分析了SATs与VATs内的生物学调控通路差异。为猪肉质改良和研究不同部位脂肪组织生物学功能差异提供了依据。 摘要5-7Abstract7-10高频词对照表10-15第一章 文献综述15-44第一节 脂肪组织的新认识15-18 1.1 脂肪组织的分类16-17 1.2 脂肪组织——重要的内分泌器官17-18第二节 不同部位脂肪组织与代谢疾病的关系18-23 2.1 皮下脂肪与内脏脂肪在生理代谢上的差异20-21 2.2 皮下脂肪和内脏脂肪与代谢疾病的关系21-22 2.3 脂肪细胞因子的组织表达特异性22-23第三节 miRNA与脂肪沉积23-34 3.1 miRNA简述23 3.2 miRNA的生成及调控机制23-24 3.3 miRNAs与肥胖的关系24-25 3.4 miRNAs在脂肪生成中的角色25-33 3.5 肥胖引起的miRNAs异常表达33-34第四节 miRNAs调控的脂肪细胞生物学过程34-40 4.1 miRNAs与脂肪细胞的分化34-37 4.2 miRNAs调控多能干细胞甘油三酯的沉积37-38 4.3 miRNA调节脂肪细胞分化的分子途径38-40第五节 调控miRNAs表达的因素40-41 5.1 细胞因子40 5.2 葡萄糖40-41 5.3 高脂饮食41第六节 脂肪组织miRNA表达谱研究的重要性 41-44第二章 本研究选题背景与目的意义44-46第一节 选题背景44-45第二节 主要研究及目的意义45-46第三章 不同部位脂肪组织表型差异分析46-57第一节 前言46-47第二节 材料方法47-53 2.1 实验动物47-48 2.2 试剂与仪器48-49 2.3 脂肪细胞体积测定49-50 2.4 脂肪组织中炎症相关基因的表达量50-52 2.5 结果统计52-53第三节 结果分析53-55 3.1 脂肪组织石蜡切片53 3.2 脂肪细胞体积测定53-54 3.3 脂肪组织炎症相关基因定量54-55第四节 讨论55-57 4.1 猪作为模式动物研究的重要性55 4.2 不同部位猪脂肪细胞的体积差异55-56 4.3 炎症相关因子与脂肪沉积56-57第四章 不同部位脂肪组织miRNAs文库构建57-72第一节 前言57-59第二节 材料与方法59-64 2.1 实验材料59 2.2 实验试剂与仪器59-60 2.3 实验方法60-64第三节 结果与分析64-70 3.1 总RNA质检结果64-65 3.2 测序数据特征65-70第四节 讨论70-72 4.1 miRNA-seq的优点70-71 4.2 脂肪组织small RNA文库特征分析71-72第五章 不同部位脂肪组织miRNAs表达谱特征72-83第一节 前言72-74第二节 材料方法74-76 2.1 数据来源74-75 2.2 参考数据库75 2.3 方法步骤75-76第三节 结果与分析76-81 3.1 miRNAs变异体76-77 3.2 miRNA分类及命名77-78 3.3 miRNAs文库分组差异比较78-81第四节 讨论81-83 4.1 基于高通量测序技术的miRNA研究81 4.2 脂肪组织miRNAs文库表达谱特征81-83第六章 皮下与内脏脂肪miRNA表达谱差异分析83-100第一节 前言83-84第二节 方法步骤84-85 2.1 分析方法84-85 2.2 分析软件85第三节 结果85-97 3.1 文库间miRNAs表达个数差异85-87 3.2 文库高丰度miRNA的分析87-88 3.3 miRNA的组织表达模式归类88-90 3.4 共表达miRNAs的聚类研究90-94 3.5 SATs与VATs差异表达miRNAs94-97第四节 讨论97-100 4.1 不同部位脂肪组织miRNAs的表达数量差异97-98 4.2 猪脂肪组织miRNAs聚类分析98 4.3 高丰度差异miRNAs的种类98-100第七章 皮下与内脏脂肪差异表达miRNAs的生物信息学分析100-125第一节 前言100-101第二节 分析策略及方法101-102 2.1 miRNA靶基因预测101 2.2 miRNA靶基因GO(Gene Ontology)分析101 2.3 miRNA靶基因Pathway分析101-102第三节 结果102-121 3.1 差异表达miRNA的相似性比较102-103 3.2 差异表达miRNAs的靶基因预测103-104 3.3 GO和Pathway term分类结果104-106 3.4 皮下脂肪与内脏脂肪差异表达miRNAs的Pathway映射106-121第四节 讨论121-125 4.1 皮下脂肪中高表达的miRNAs与脂肪代谢密切相关121-122 4.2 内脏脂肪中高表达的miRNAs的生物学功能分析122- 1.3 皮下脂肪与内脏脂肪的生物学功能差异123-125第八章 结论125-126 参考文献 126-147致谢147-148附件148-211附件1 鉴定的Unique miRNA总表148-166附件2 miRNAs组织表达模式归类总表166-201附件3 差异表达miRNAs总表201-204附件4 富集的GO和Pathway总表 (p204-211博士在读期间发表情况211