谷氨酰胺合成酶测定

谷氨酰胺合成酶测定 谷氨酰胺合成酶(GS)活性测定 一、实验原理 谷氨酰胺合成酶(GS)是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP 2+和Mg存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ?谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ?谷氨酰基异羟肟酸与 ,1,1铁络合物的生成量来表示，单位μmol?mgprotein?h。也可间 ,1,1接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A?mg protein?h。 二、实验仪器与用具 冷冻离心机;分光光度计;天平;研钵;恒温水浴;剪刀;移液管(2ml、1ml) 三、实验试剂 (1)提取缓冲液(0.05mol/LTris-HCl，pH8.0)。 内含2mmol/L2+Mg，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。称取Tris(三羟甲基氨基甲烷)1.5295g，0.1245g MgSO?7HO，0.1543g DTT(二硫苏糖醇)和34.25g42 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl(0.1mol/L = 1ml的 36%~38%浓盐酸加入到100ml去离子水里)调至pH8.0，最后定容至250ml; (2)反应混合液A(0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4)。 内含 2+80mmol/L Mg，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA。称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO?7HO, 0.8628g谷氨酸钠42 1 盐，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml; (3)反应混合液B(含盐酸羟胺，pH7.4)。 反应混合液A的成分 再加入80mmol/L盐酸羟胺，pH7.4; (4)显色剂(0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl和0.6mol/L HCl混3 合液)。 3.3176g TCA(三氯乙酸)，10.1021g FeCl?6HO，去离子水溶解后，32 加5ml浓盐酸，定容至100ml; (5)40mmol/L ATP溶液。 称取0.1210g ATP溶于5ml去离子水中(临用前配制) 四、方法步骤 1.粗酶液提取 称取植物材料0.5-1g与于研钵中，加3ml(实际情况作调整)提取 -1缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4?下12,000r.min离心20min，上清液即为粗酶液。 2.反应 1.6ml反应混合液B，加入0.7ml粗酶液和0.7ml ATP溶液，混匀，于37?下保温半小时，加入显色剂1ml，摇匀并放置片刻后， -1于5,000 r.min下离心10min，取上清液测定540nm处的吸光值，以加入1.6ml反应混合液A的为对照。 3.粗酶液中可溶性蛋白质测定 取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取1ml用考马斯亮蓝G-250测 2 定可溶性蛋白质(方法待定，试着不用定容直接测，即取样品液1ml，如蛋白含量高，再适当稀释，加考马斯亮蓝5ml，在595nm下测定吸光值，注意应放置10min后在测，在1h内比色完) 4.结果计算 GS活力=A/(P.V.T) 式中 A—540nm处吸收值 P---粗酶液中可容性蛋白的质量浓度(mg/mL) V---反应体系中加入的粗酶液体积(mL) T---反应时间 GS活力是以每毫克酶蛋白在每小时催化生成的γ?谷氨酰基异羟肟酸与铁络合的产物在540nm处的吸光值的大小来表示 注意:在测酶时，由于各酶活力大小的表示都是以每小时/min产生生成一定量的产物的量来表示，不同的时间长度产生产物的量不同，所以在测量时，要严格控制时间，要保证测同一指标的各批次材料在处理时间(反应时间)要严格一致～～～ 3