[doc] 曲尼司特对犬颈动脉球囊损伤模型的抗狭窄作用

[doc] 曲尼司特对犬颈动脉球囊损伤模型的抗狭窄作用 曲尼司特对犬颈动脉球囊损伤模型的抗狭 窄作用 750中国临床医学2008年12月第15卷第6期 ? 论着? 曲尼司特对犬颈动脉球囊损伤模型的抗狭窄作用 宿燕岗沈建颖王现姚瑞明贾剑国孙爱军王克强邹云增葛均波 摘要目的:通过球囊损伤犬颈动脉模型观察曲尼司特对颈动脉损伤后再狭窄的作用.:9只犬被随机分为对照组(: 5)及曲尼司特干预组(50mg?kg,”=4),颈总动脉损伤前2周及术后4周进行分组干预.通过测定血浆AngI及Ang1I水 平,糜酶(chymase)mRNA达水平,颈动脉细胞增殖核抗原(PCNA)阳性率及颈动脉各层厚度观察曲尼司特对犬颈动脉损 伤后狭窄的作用.结果:两组血浆AngI,Ang?水平及颈动脉外/中膜厚度无明显改变(P>0.05);但曲尼司特组较对照组的 糜酶mRNA表达(A值分别为0.425?0.114比0.708?0.083),颈动脉各层PCNA阳性率(内膜:0.45?0.05比0.57? 0.12,中膜:0.54?0.05比0.61?0.02,外膜:0.25?0.10比0.36?0.08)及颈动脉内/中膜厚度(0.518?0.044比0.576? 0.028)均明显降低,P<0.05.结论:曲尼司特通过糜酶途径对犬颈动 脉球囊损伤后的再狭窄具有抑制作用. 关键词糜酶;血管紧张素;曲尼司特;再狭窄;血管增生 中图分类号R976文献标识码A restenosisbyTranilastonBalloon—injuredDogCarotid TheEffectofAnti— ArterySL,YangangSHEN Jianying.W_ANGXianA0RuimingJIAJianguoSUNAijRnWANGKeqiangZOU YunzengGEJunbo1.DepartmentofCardiology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shang- hai200032;2.DepartmentofCardiology,Sanghai10PeoplesHospital,TongJiUniversity, Shanghai200072;3.Shanghai8PeoplesHospital,Shanghai200235 AbstractObjective:Toinvestigattheanti—restenosiseffectoftranilastonthe balloon—injureddogcarotidarteris.Methods:Ei— thertranilast(50mg?kg,”=4)orvehicle(7=5)wasorallyadministeredtodogsfor2weeksbeforeand4weeksafterbal— looninjury.PlasmaAngIandAng? levels,chymasemRNAlevels,arteriesPCNApositivepercentsandthethicknessofca— rotidarteryweremeasured.Results:Fourweeksaftertheinjury,nodifferenceswasfoundbetweeneachgroupontheplasma AngI,Ang1Ilevels,andcarotidadventitia/mediaratio,P>0.05.Buttranila streducedchymasemRNAlevels(0.425? 0.1】 4vs0.708?0.083),carotidPCNApositivepercents(intima:0.45?0.05vs0.57? 0.12,media:0.54?0.05vs0.61? O.02,adventitia:0.25?0.10vs0.36?0.08)andintima/mediaratio(0.518?0.0 44v80.576?0.028),P<0.05.Conclu- sion:SuppressionofthechymasedependentAng11一 formingpathwaymaycontributetotheeffectofanti—restenosisoftranilast. KeyWordsChymase;Angiotensin;Tranilast;Restenosis;Angiogenesis 人类心血管系统存在多种非血管紧张素转化酶 (ACE)依赖的血管紧张素1I(Ang1I)生成途径,其 中又以糜酶(chymase)途径最为重要.Ang1I的水 平与许多心血管疾病的预后明显相关.近年研究证 实,经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)后再狭窄的 重要原因为血管平滑肌和内皮细胞增生,而Ang1I 被认为在此过程中起重要作用.Tsunemi等_1发现 由于糜酶介导大部分Ang?的生成,所以只有Ang ?受体阻断剂(ARB)可以有效抑制犬移植静脉的 血管增生;而血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)则无 此作用.糜酶在正常血管组织中以非活性形式贮存 在肥大细胞内,当肥大细胞受到诸如导管损伤或移植 物的强烈刺激后,就会激活糜酶从而促进合成Ang 引 .曲尼司特(tranilast)作为一种能稳定肥大细胞 膜的抗过敏药,可能对糜酶的释放及其介导的AngH 的生成起一定的抑制作用,进而起到降低PTCA后再 狭窄的效应.本研究通过球囊损伤犬颈动脉模型观 作者单位:1.复旦大学附属中山医院心内科,上海200032; 2.同济大学附属第十人民医院心内科,上海200072;3.上 海市第八人民医院,上海200235 察曲尼司特对颈动脉损伤后再狭窄的作用. 1资料与方法 1.1分组及给药成年健康犬9只,雌雄不限,体 重约为10kg;随机分为两组:曲尼司特药物干预组 (予曲尼司特50mg?kg)4只,对照组5只,给予 赋形剂.在球囊损伤前2周给药,球囊损伤后继续 给药4周. 1.2犬颈总动脉球囊损伤模型的建立采用球囊 导管摩擦颈总动脉内膜建立损伤模型.将犬固 定,戊巴比妥钠静脉麻醉后纵向切开左侧颈部皮肤 约2cm,钝性分离出颈动脉及甲状腺动脉后经甲状 腺动脉插入3F球囊导管至左颈动脉,扩张球囊并 反复前后拉动3次以造成颈动脉内膜损伤.右颈动 脉作为正常对照.4周后,将犬固定,戊巴比妥钠静 脉麻醉后放血处死,取下双侧颈动脉,0.9氯化钠 溶液冲洗干净后放入液氮保存. 1.3血浆AngI及AngII水平和糜酶mRNA表 达的测定在术前及术后4周分别取静脉血4mL, 按照试剂盒操作说明加入抗凝剂混匀后4IC离心(2 500Dm)7min,取上清进行检测.每样本测3次取 均值.采用RT—PCR检测糜酶mRNA的表达,样 中国临床医学2008年12月第15卷第6期ClinicalMedicalJournalofChina,2008.Vo1.15,No.6751 品总RNA提取采用Trizol试剂盒,操作按试剂盒 说明进行.用A260/A280测定RNA浓度和纯度, 取2g总RNA逆转录成cDNA,取2LcDNA进 行PCR扩增.内参为J3一actin,上游引物:5gaatcc caaagccaaccg一3,下游引物5tgtcacgcacgatct CCC一3,产物长度为305bp,95C变性30S,58?退火 30S,72?延伸30S,循环30次;chymase上游引物: 5I_agagcagaagctgaggagatcat一3,下游引物5 gagcctgatccattgacttatct一3,产物长度为431bp, 95?变性30S,65?退火30S,72?延伸30S,循环 30次.扩增产物于1.5琼脂糖凝胶电泳,凝胶成 像系统扫描,用软件分析并计算chymase/~一actin两 者吸光度(A)的比值. 1.4颈动脉组织增殖细胞核抗原(PCNA)阳性率 测定采用免疫组化方法.颈动脉用中性甲醛固定 后石蜡包埋,行5/,m连续切片.常规脱腊水化后 以3过氧化氢阻断内源性过氧化物酶.滴加封闭 血清孵育后加入小鼠抗PCNA单克隆抗体(1/ 100),4?过夜,洗去后加人生物素偶联的山羊抗小 鼠的二抗(1/200)37?孵育30min,PBS冲洗后加 入卵白素和生物素偶联的辣根过氧化物酶,静置30 min后滴加DAB显色.苏木素复染后脱水,透明, 封片.光镜下(400倍)观察并通过计算机采集图片 分析每个视野里的PCNA阳性细胞(呈棕色)的百分 比,每张切片的内膜,中膜及外膜分别随机取3个不 同的视野,求得PCNA阳性率的均值进行统计分析. 1.5颈动脉内膜,中膜及外膜厚度检测采用HE 及Weigert弹力纤维染色和VanGieson胶原纤维 染色.光镜下观察内外弹力膜并用图像分析软件计 算每张切片3个不同方向的血管内膜,中膜及外膜 的厚度,求得每个方向血管内膜及外膜与中膜厚度 的比值,取均值,进行统计分析. 1.6主要试剂曲尼司特由中国药科大学制药有 限公司馈赠;Ang工及Ang1I放射免疫分析试剂盒 购自北京北方生物技术研究所;Trizol购自BBI公 司;M—MLVRT,RNasin及TaqBeadHotStart Polymerase购自Promega公司;moL1seanti—PCNA 购自gymed公司;ABCStainingSystem购自Santa Cruz公司. 1.7统计学处理所有数据以均数?差表示, 使用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析,P d0.05差异有统计学意义. 2结果 2.1血浆Ang工及Ang1I水平测定对照组术前 血浆AngI浓度为6.69?0.98ng?mL,术后为 6.61?1.38ng?mL,;曲尼司特组术前为6.71? 0.87ng?mL,术后为6.25?0.71ng?mL.对 照组与曲尼司特组之间及两组手术前后之间均无统 计学差异,各组间均P>0.05. 对照组术前血浆Ang1I浓度为1O7.30?13.05 pg?mL,术后为106.19?27.53Pg?mL;曲尼 司特组术前为104.50?11.02Pg?m,术后为 106.29?32.56Pg?mL’..对照组与曲尼司特组之 间及两组手术前后之间均无统计学差异,各组间比 较均P>0.05. 2.2RT—PCR检测糜酶mRNA的表达对照组 颈动脉损伤侧糜酶表达较未损伤侧明显增加(P< 0.05);曲尼司特组颈动脉损伤侧较对照组损伤侧明 显下降,接近未损伤侧表达水平(P<0.05)(图1). 1:对照组未损伤侧;2:对照组损伤侧; 3:曲尼司特组未损伤侧;4:曲尼司特组损伤侧 图1各组糜酶mRNA表达水平 2.3PCNA免疫组化染色及阳性细胞计数对照 组犬损伤侧内膜PCNA阳性率较对照组未损伤侧 及曲尼司特组损伤侧和未损伤侧均明显提高(P< 0.05);对照组犬损伤侧中膜及外膜PCNA阳性率均 较两组未损伤侧明显提高(P%0.05),但与曲尼司特 组损伤侧相比无统计学差异(P>0.05);曲尼司特组 损伤侧内膜,中膜及外膜PCNA阳性率与两组未损 伤侧相比无显着差异(P>0.05)(表1及图2). 2.4血管内膜及外膜与中膜厚度之比(图3,4) 对照组颈动脉损伤侧内膜/中膜厚度明显增加,与其 他各组相比均有统计学差异(P<0.05);曲尼司特 组损伤侧与对照组损伤侧相比明显降低(P< 0.05),与未损伤侧相比无明显增加(P>0.05)(图3 及图4).两组损伤侧与未损伤侧外膜/中膜厚度无 显着差异(P>0.05). 采用了Weigert弹力纤维染色和VanGieson 胶原纤维染色,图中绿色示弹力纤维;红色示胶原纤 维;黄色示肌组织. 颈动脉由绿色的弹力纤维分界为内膜,中膜和 外膜.图4示未损伤侧颈动脉的内膜很薄,内膜和 中膜之间为波浪状的内弹力膜;中膜很厚,由多层弹 性膜组成,弹性膜主要由弹力纤维相连,间有平滑肌 细胞和胶原纤维.对照组损伤侧颈动脉的内膜明显 增厚并伴有大量的胶原纤维生成,内弹力膜形态不 规则伴断裂.曲尼司特组损伤侧颈动脉的内膜亦较 未损伤侧增厚,但程度轻于对照组损伤侧,不伴有胶 原纤维的增加,内弹力膜呈波浪形,无断裂现象. 987654321)盯%?叭0 752ClinicalMedicalJournalofChina,2008.Vo1.15,No.6中国临床医学2008年12月第15卷第6期 与对照组未损伤侧及曲尼司特组损伤侧和未损伤侧比较,P<().05; 与对照组未损伤侧及曲尼司特组未损伤侧比较,P%O.05;与曲尼 司特组损伤侧比较,P>().05;与对照组未损伤侧及曲尼司特组未损伤侧比较,P>0.05. !:00| . l|!?I2| jti|. tf||| ,.f?. r . , ||il|菇.一._擘_ll ;’?0i_lI1l. ._l童1墙.|霉{l,||0 |.|-..0 A:对照组损伤侧内膜,中膜PCNA染色;B:对照组损伤侧外膜PCNA 染色;C:曲尼司特组损伤侧内膜,中膜PCNA染色;D:曲尼司特 组损伤侧外膜PCNA染色 图2犬颈动脉PCNA免疫组化染色(X400倍) 犬颈动脉损伤后内膜与中膜厚度之比犬颈动味损伤后外膜与中膜厚度之比 ??图3各组内膜中膜厚度之比及外膜中膜厚度之比 未损伤侧对照组损伤侧曲尼司特组损伤侧 图4犬颈动脉弹力纤维及胶原纤维染色(X200倍) 3讨论 本研究证实犬颈动脉球囊损伤前后血浆Ang I及AngII水平无变化,曲尼司特组与对照组间亦 无差异;但颈动脉球囊损伤可导致糜酶的mRNA表 达增加伴有细胞增殖和内膜增厚的现象,而曲尼司 特通过抑制糜酶mRNA的表达减轻细胞增殖和内 膜增厚的程度. 近来的研究证实有多种非ACE依赖的Ang ?生成途径,它们分别由糜酶,cathepsinG等介 导,其中又以糜酶途径最为重要.糜酶是一种分子 量为29kD的糖蛋白,其底物主要为Ang工和神经 紧张素,其活性能被糜酶抑素(chymostatin),SBTI (豆类的胰蛋白酶抑制剂),PMSF和TPCK等物质 抑制].肥大细胞被认为是过敏反应中的关键细 7654321O叫. 蹬型子\盍f ?叽0 OOOOOOOO 毗型,吐长 中国临床医学2(J08年I2月第15卷第6期 ClinicalMedicalJournalofChina,2008.Vo1.15,No.6753 胞,生成50余种丝氨酸肽链内切酶,其中多数有胰 蛋白酶或糜蛋白酶样活性[6.免疫细胞化学及原位 杂交等方法均证实糜酶在肥大细胞的分泌颗粒中合 成和贮存,当肥大细胞受到强烈刺激,如导管损伤, 血管移植等,即被激活,并立即释放糜酶至细胞外基 质,作用于底物AngI使其生成Ang1I,使后者浓 度升高,提示糜酶主要在病变血管的Ang1I生成 中起主要作用...本研究亦发现球囊损伤侧颈动 脉糜酶的mRNA活性表达明显增加,且曲尼司特可 以显着抑制糜酶mRNA的表达;但球囊损伤前后犬 血浆中AngI及Ang?水平无明显改变,说明糜酶 主要在损伤的血管组织中起到调节局部Ang?水 平的作用,对正常血管组织和整体的Ang?生成不 起作用.Takai等一通过犬颈动脉球囊损伤模型发 现受损颈动脉局部内膜增生伴糜酶活性增高,而 ACE活性未改变.饲以糜酶抑制剂NK3201后,受 损颈动脉的糜酶活性被显着抑制,且内膜面积较对 照组明显减小,血浆肾素和ACE活性无改变,提示 NK3201通过抑制糜酶起到预防球囊损伤动脉的内 膜增生的作用.在本研究中,我们通过检测PCNA 观察细胞的增殖情况,对各组颈动脉PCNA免疫组 化染色结果进行分析发现血管损伤侧的PCNA阳 性细胞较未损伤侧明显增加,且曲尼司特可以部分 抑制该作用,并以对内膜的作用更为显着.而对血 管内膜,中膜及外膜厚度的分析结果发现未服药组 损伤侧的血管内膜较未损伤侧明显增厚,而曲尼司 特组损伤侧的血管内膜增厚不明显,与未损伤侧相 比无统计学差异;但各组问的外膜与中膜厚度之比 无明显差别.结合糜酶mRNA表达水平的检测结 果,本研究结果提示曲尼司特可以抑制肥大细胞颗 粒内糜酶介导的血管损伤后内膜增生. 已发现糜酶可促进血管平滑肌细胞的迁移,并 激活前基质金属蛋白酶一2(proMMP2)为活性形式 的基质金属蛋白酶一2(MMP2).血管壁受损后,在 增生的管壁局部MMP_2明显增加,伴有糜酶活性的 增加.饲以NK3201后,新生内膜的生成以及MMP_ 2和糜酶活性的增高均被抑制.这说明糜酶抑制剂 通过抑制MMP-2起到抑制血管内膜增生的作用l1.. 这也许是本研究中曲尼司特通过抑制糜酶起到预防 犬颈动脉球囊损伤后内膜增生的机制之一. 有研究t-发现曲尼司特未能降低经皮冠状动脉 介入治疗(PCI)术后3个月的再狭窄率.动物实验与 临床实验的不一致主要考虑为药物剂量的差别,曲尼 司特用于抑制血管增生所需的剂量很大,为抗过敏时 剂量的10倍以上l113];此外,给药时间亦不相同,在 动物实验中为提前给药,而在临床试验中为PCI术后 给药.曲尼司特作为一种抗过敏药,在临床用于哮喘 时主要是预防性提前给药,从而起到稳定肥大细胞膜 的作用,这可能是两者结论不同的原因. 总之,本研究通过建立犬球囊损伤模型来观察 曲尼司特(一种肥大细胞稳定剂)对糜酶介导的血管 组织增殖的影响,证实了糜酶途径在血管增生性疾 病中不可替代的作用.因此,预防血管增生性疾病 有3个靶点:稳定肥大细胞,抑制Ang1I受体和抑制 chymase,对ehymase抑制剂进行进一步的开发及 研究无疑对血管增生相关疾病有着重要的意义. 致谢:本研究承蒙复旦大学医学院病理教研室 朱静珍老师,复旦大学附属中山医院核医学科顾伟 光老师协助. 参考文献 1TsunemiK,TakaiS,NishimotoM,eta1.Lengthysuppression ofvascularproliferationbyachymaseinhibitorindoggrafted veins[J].JThoracCardiovascSurg,2002,124(3):621—625. 2MiyazakiM,TakaiS.Roleofchymaseonvascularproliferation[J]. 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